Таблица 1. Структура экспериментальной платформы для исследования субинтерактомов целевых белков.

Блок

Название

Методы

Описание

I

Получение тканевых или клеточных лизатов

Перевод биологического материала в жидкую фазу

Гомогенизация биологического материала в присутствие лизирующего буфера с добавлением ингибиторов протеолитических ферментов

II

Аналитический молекулярный фишинг

SPR анализ

Предварительная оценка связывания белков лизата с целевым белком

III

Препаративный молекулярный фишинг

Аффинная хроматография c
 LC-MS/MS анализом выделенных белков

Идентификация потенциальных белковых партнеров целевого белка

IV

Фракционирование лизата по молекулярной массе

Высокоэффективная SEC-хроматография и LC-MS/MS анализ белков во фракциях

Идентификация ко-фракционированных белков и предсказание белковых комплексов с участием целевого белка

V

Верификация белок-белковых взаимодействий

SPR анализ

Количественная оценка белок-белковых и белок-пептидных взаимодействий с определением кинетических (kon и koff), равновесных (Kd) и термодинамических параметров (ΔG, -TΔS и ΔH).

 Примечание. Kd - равновесная константа диссоциации, kon и koff - константы скоростей ассоциации и диссоциации комплексов, ΔG - изменение свободной энергии Гиббса, -TΔS - изменение энтропии, ΔH - изменение энтальпии.