|
Разработка метода экстракции тотального протеома спор Bacillus anthracis 1Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15;*e-mail: postgenom_stv@mail.ru Ключевые слова: Bacillus anthracis; протеом спор; экстракция протеомного комплекса; лизирующие растворы; дезинтеграция; 2D гель-электрофорез DOI: 10.18097/BMCRM00154 ВВЕДЕНИЕ Споры B. anthracis – важная морфофункциональная форма существования возбудителя сибирской язвы. Основное патогенное воздействие, фатальное для чувствительных к этойинфекцииорганизмов, осуществляется непосредственно вегетативной формой бацилл, и в этот же период происходит бурное размножение возбудителя. Тем не менее, способность к образованию спор у патогенных микробов является залогом их сохранения в межэпизоотический период [1]. Химический состав и строение оболочек спор играет важную роль в устойчивости к губительному воздействию факторов внешней среды, чувствительности к герминантам в различных условиях, в том числе в организме теплокровных животных, иммуногенности непосредственно спор [2]. Поиск и валидация белковых маркеров споровой формы сибиреязвенного микроба имеет большое значение для разработки систем раннего обнаружения патогена и организации противодействия актам биотерроризма [3]. Развитие современных методов, связанных с тотальным протеомным картированием на основе комплексного применения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тандемной времяпролетной масс-спектрометрии, позволило идентифицировать белки, которые ранее не ассоциировались со споровой формой сибиреязвенных бацилл [4]. Споры возбудителя сибирской язвы обладают особой устойчивостью к физическим и химическим факторам, что во многом определяется особенностями состава и строения их оболочек [5]. Это затрудняет получение экстракта спор в концентрации, достаточной для дальнейшего протеомного анализа. В работе [6] показано влияние скорости спорообразования у штаммов B. anthracis с разным комплексом биологических свойств на эффективность экстракции тотального протеома вегетативных клеток бацилл. Также важным условием качественной пробоподготовки образцов является нахождение культуры в одной морфофункциональной фазе, так как и спорообразование, и герминация спор влияют на изменение белкового состава исследуемых штаммовB. anthracis Целью работы была разработка метода эффективного лизиса споровой формы B. anthracis и экстракции клеточных белков в сочетании с надежным обеззараживанием лизатов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали 7 штаммов B. anthracis: (а) диплазмидные вирулентные штаммы: 1284, выделенный из пельменей (Омск, 2010 г.); 81/1, выделенный в 1969 г. в Ставропольском крае из материала от больного; 1(СО)-S, образующий капсулу на обычных питательных средах в атмосфере воздуха; (б) 4 бесплазмидных варианта штаммов B. anthracis: ΔСТИ, ΔSterne, 228/4, 1(СО)-23. Штаммы B. anthracis были получены из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» Ставропольского противочумного института. В работе были использованы питательные среды: LB broth («VWR Life Science Amresco», США), tryptic soy broth («Liofilchem», Италия), microbiology agar («Sigma», США); реактивы: L-histidine(«VWRLife ScienceAMRESCO», США), TWEEN-80, pure («AppliChem», Германия), trifluoroacetic acid spectroscopy grade, ultrapure («AppliChem» Германия), мочевина, ultra pure grade, («VWR Life Science AMRESCO», США), Acetonitrile, HLPC-gradient grade («AppliChem», Германия), α-цианогидроксикоричная кислота (CHCA) («Bruker Daltonics», Германия), трихлоруксусная кислота (ТХУ, «AppliChem», Германия), ингибитор бактериальных протеаз («VWR Life Science AMRESCO» США), Трис основной, ultra pure grade, («VWR Life Science AMRESCO», США), тиомочевина ultra pure grade, («VWR Life Science AMRESCO», США), гуанидин гидрохлорид, molecular biology grade, («Sigma», США); DTT molecular biology grade, («AppliChem», Германия), глицерин чистый для анализа, ГОСТ 6259-75 (Россия). Работу с образцами спор штаммов B. anthracis проводили с соблюдением требований СП 1.3.3.118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Споры выращивали в течение 7 суток на среде Гладстона-Филдса с контролем полноты спорообразования, смывали стерильной дистиллированной водой (ДВ) при достижении спорообразования 95%. При необходимости проводили отмывку спор ДВ от бациллярного дебриса. Эффективность воздействия таких химических реагентов, как ТХУ и лизирующие растворы, а также физических факторов (механическая дезинтеграция) на споры штаммов B. anthracis в процессе экстракции протеома оценивали как инструментальными методами, описанными ниже, так и визуально по внешнему виду спор в мазках, окрашенных методом Ребигера. Пробоподготовку проводили несколькими вариантами, включавшими обработку нативной споровой взвеси или предварительно подвергнутой воздействию 20% ТХУ при -20°С в течение 24 ч лизирующими буферами, содержащими 6 М гуанидин хлорид или 8 М мочевину/2 М тиомочевину с последующей дезинтеграцией с использованием циркониевых шариков (или без этого этапа) (рис. 1).
Для предотвращения деградации экстрагируемых белков в лизирующий буфер вносили ингибиторы бактериальных протеаз (табл. 1).
На конечном этапе осуществляли дополнительное обеззараживание образцов и удаление клеточного дебриса при помощи ультрамикроцентрифужной стерилизующей фильтрации лизата через PVDF-фильтр («Merk/Millipore», Германия) с размером пор 0.22 мкм под контролем на специфическую стерильность методом посева на питательные среды и постановкой биопроб. Для этого полученные фильтраты штаммов B. anthracis нейтрализовали [7], и использовали для посевов и заражения животных. Посевы производили по 0.1 мл пробы на 5 чашек Петри с LB-агаром (по Ленноксу), которые инкубировали при 37°С в течение 5 суток с ежедневным просмотром на наличие специфического роста. Для подтверждения надежности обеззараживания биологическим методом белым беспородным мышам массой 20±1 г (5 животных на каждую пробу) вводили по 0.5 мл пробы подкожно на внутренней поверхности бедра, после чего наблюдали за ними в течение 10 суток. В случае гибели животных проводили их вскрытие с просмотром окрашенных мазков-отпечатков и посевом на питательные среды. Положительным контролем служили взвеси необработанных спор соответствующей концентрации в нейтрализующем бульоне, отрицательным контролем – стерильный нейтрализующий бульон. Механическую дезинтеграцию образцов проводили с использованием прибора Mini- BeadBeater 16 («Biospek», США) и расходных материалов к нему. Сравнительную оценку полноты экстракции тотального протеома из споровых клеток осуществляли по количеству, интенсивности и четкости разделения белковых полос, полученных при одномерном электрофоретическом разделении образцов на автоматической системе капиллярного электрофореза Experion («Bio-Rad», США) с использованием набора Experion Pro260 Analysis Kit («Bio-Rad») после предварительной очистки образцов набором Ready Prep 2-D Cleanup Kit («Bio-Rad»). Двумерный электрофорез проводили с использованием комплекта оборудования для протеомных исследований «Bio-Rad» и специализированного программного обеспечения Quantity One 1-D analysis software («Bio-Rad»). Концентрацию белка в образцах перед проведением электрофореза в первом направлении измеряли на флюориметре Qubit («Thermo Fischer», США) и параллельно методом Бредфорда с использованием спектрофотометра Smart Spec Plus («Bio- Rad»). Изоэлектрофокусировку проводили в приборе Protean IEF Cell с применением полосок «ReadyStrip IPG strips» 7 см, pH 4-7, («Bio-Rad»), загружая образцы из расчета 10-15 мкг белка на 0.25 мл регидратационного буфера, который готовили согласно рекомендациям производителя стрипов (ReadyStrip IPG strips instruction manual, cat #163-2099). Стрипы уравновешивали в буфере с 6 М мочевиной в два этапа: с 2% дитиотреитолом и 2.5% йодацетамидом по 15 мин. Электрофорез во втором направлении проводили в камере Mini Protean («Bio-Rad») в 12% ПААГ в течение ~1.5 ч. Готовые гели окрашивали набором PieuceTM Zinc Reversibble Stain Kit («Thermo Fischer»). Изображения окрашенных гелей визуализировали при помощи системы Densitometr GS-800 («Bio-Rad»). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Работу проводили со взвесями с концентрацией 1х108 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Убедившись, что взвесь спор не содержит вегетативной культуры и дебриса, образец центрифугировали, к осадку добавляли 0.5 мл 20 % ТХУ и аккуратно перемешивали пипетированием. После этого образец на 24 ч выдерживали при -20°С. Далее пробы размораживали на воздухе и центрифугировали при 16000 g 10 мин. К осадку добавляли 500 мкл охлажденного ацетона, ресуспендировали осадок пипетированием и центрифугировали при 16000 g 10 мин. Процедуру отмывки повторяли еще раз. После обработки спор 20% ТХУ они приобретали способность интенсивно прокрашиваться, выглядели более округлыми и теряли четкость контуров (рис. 2 б) в отличие от спор, не обработанных ТХУ (рис. 2 а). Далее образцы спор инкубировали в течение 2 ч при 37°С в одном из лизирующих буферов, содержащих 6 М гуанидин хлорид или 8 М мочевину/2 М тиомочевину в присутствии коктейля ингибиторов бактериальных протеаз. Обработка обоими лизирующими буферами мало влияла на внешний вид спор в мазках у всех штаммов (рис. 2 в и д) по сравнению с предыдущим этапом. После инкубации в одном из лизирующих буфереров, часть образцов подвергали механической дезинтеграции в присутствии циркониевых шариков в следующем режиме: 2 цикла по 3 мин. Для предотвращения нагревания образцов между циклами дезинтеграции их помещали на 30 с в ванночку со льдом. Далее пробирки с образцами центрифугировали 5 мин при 24000 g. Из осадка делали мазки (рис. 2 г и е). На представленных парных фотографиях из осадка материала до этапа механической дезинтеграции спор штамма B. anthracis 1(CO)-23 и после указанной процедуры можно отметить практически полное исчезновение интенсивно окрашенных структурированных спор (особенно после обработки лизирующим буфером с 6 М гуанидин хлоридом) при наличии лишь аморфного дебриса, что может свидетельствовать о более интенсивном воздействии на споры в процессе экстракции их протеома.
На следующем этапе проводили обеззараживание проб методом ультрамикроцентрифужной фильтрации лизата через PVDF-фильтр с размером пор 0.22 мкм. Следует отметить, что образцы, не подвергшиеся обработке ТХУ и механической дезинтеграции, фильтровались с большим трудом, формируя на микрофильтре плотный осадок, затрудняющий прохождение жидкости через поры, вследствие чего приходилось дважды менять фильтрующую насадку. Кроме того, полученный после фильтрации объем образца был примерно в 2 раза меньше (0.15-0.20 мл), чем у образцов, подвергшихся обработке ТХУ и дезинтеграции. Проверка на специфическую стерильность методом посева на питательные среды и постановкой биопробы>материала, полученного на конечном этапе, не выявила жизнеспособной культуры B. anthracis, что позволяет использовать этот метод при проведении протеомного анализа споровой формы штаммов сибиреязвенного микроба. Для проверки влияния процедуры механической дезинтеграции на эффективность экстракции белкового комплекса спор B. anthracis проводили сравнительную оценку качества полученных экстрактов штаммов В. anthracis 1284 и ∆Sterne, полученных под воздействием двух лизирующих буферов с применением механической дезинтеграции и без нее по количеству и интенсивности белковых полос, полученных при одномерном электрофоретическом разделении белков с использованием автоматической системы капиллярного электрофореза Experion («Bio-Rad») и набора Experion Pro260 Analysis Kit («Bio-Rad») после их предварительной очистки набором Ready Prep 2-D Cleanup Kit («Bio-Rad») (рис. 3.).
Сравнительный анализр езультатов различных вариантов получения белковых комплексов двух штаммов B. anthracis ∆Sterne и 1284 четко продемонстрировал преимущество проб, полученных с применением механической дезинтеграции после их обработки лизирующими буферными растворами. Они имели более богатый белковый спектр, распределенный по всему диапазону детектируемых молекулярных масс, в то время как образцы, не подвергшиеся дезинтеграции, имели на всем протяжении спектра меньшее количество экстрагированных белков вне зависимости от используемого буфера. Метод капиллярного электрофореза удобен для ориентировочной сравнительной оценки качества белковых экстрактов, полученных при применении различных схем их приготовления, но не обладает достаточной разрешающей способностью для разделения до отдельных белков, что необходимо для их дальнейшей идентификации методом MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии после их экстракции из геля, очистки и трипсинолиза. В связи с этим на конечном этапе был проведен 2D-электрофорез белкового экстракта спор штамма B. anthracis 1(CO)-23, полученного с применением механической дезинтеграции. На рисунке 4 представлено распределение белков, различающихся по значениям изоэлектрических точек (горизонтальное направление) и величине молекулярных масс (вертикальное направление) при использовании полосок с иммобилизованным инрадиентом pH (4-7).
При анализе белковых экстрактов образцов спор штаммов B. anthracis 1(СО)-23 (рис. 4) в диапазоне pH 4-7 было выявлено около 350 белковых пятен, молекулярная масса которых варьировала в диапазоне 36-205 кДа. Одна из первых работ, посвященных исследованию протеома спор сибиреязвенного микроба [8], не содержит четко прописанной процедуры экстракции тотального протеома спор B. anthracis и их обеззараживания. В ней имеется только ссылка на более раннюю работу [9], в которой описано обеззараживание спор (причем, не B. anthracis, а непатогенных Bacillus subtilis) путем их кратковременного прогревания в буфере SDS-PAGE. В другой работе [10] анализ белков спор проводили с использованием авирулентного (вакцинного) штамма B. anthracis Sterne методом френч-пресса и об отсутствии спор в исследуемом образце судили по результатам микроскопии, однако данный метод (микроскопия) для оценки эффективности обеззараживания недостаточно объективен и надежен. Более близкая к описываемой нами методика предложена в работе [11], авторы которой использовали для деструкции спор ультразвуковую дезинтеграцию с последующей фильтрацией образца через фильтры с диаметром пор 0.45 мкм и/или 0.22 мкм и обязательным проведением контроля образцов на специфическую стерильность. Поскольку проведенная нами апробация метода ультразвуковой дезинтеграции на выборке штаммов сибиреязвенного микроба с разной вирулентностью, включая атипичные, дала отрицательные результаты (образцы забивали фильтры, в посевах на специфическую стерильность наблюдался рост культуры), от применения ультразвуковой дезинтеграции пришлось отказаться. В дальнейшем для извлечения тотального протеома были апробированы методы, описанные в работе [12]. Её авторы провели сравнение экстракции споровых белков с применением ТХУ и механической дезинтеграции. Результаты работы свидетельствуют о преимуществе кислотной экстракции перед механической дезинтеграцией, так как этот метод более прост и позволяет получить большее количество споровых белков. В ряде ранних работ [13, 14] мы нашли сведения о том, что при длительном воздействии ТХУ на споры бацилл увеличивается проницаемость споровой оболочки к действию химических веществ. Мы также наблюдали данный эффект при микроскопии препаратов обработанных спор – они теряли четкость контуров, выглядели менее структурированными. В то же время в перечисленных публикациях приводятся данные о том, что воздействие ТХУ замедляет способность спор к прорастанию, но не лишает их жизнеспособности [15]. С учетом этих данных, при разработке метода обеззараживания спор сибиреязвенного микроба для проведения протеомных исследований, мы использовали комбинацию длительной (24 ч) обработки 20% раствором ТХУ с механической дезинтеграцией спор и ультрафильтрацией конечного образца, что привело к стабильно отрицательным результатам контроля на специфическую стерильность бактериологическим и биологическим методами, а также увеличивало количество белков, выявляемых методом электрофореза в экстрактах, и уменьшало потери конечного продукта. Выполнение этапа механической дезинтеграции после обработки спор лизирующими растворами позволило повысить полноту экстракции протеома спор (расширить спектр экстрагируемых белков в широком диапазоне молекулярных масс) и облегчить процесс стерилизующей фильтрации, уменьшив потери образца. Использование предложенной схемы пробоподготовки позволяет получать полноценные белковые экстракты спор штаммов B. anthracis, пригодные для сравнительного анализа протеома и поиска корреляции с фенотипическими свойствами. СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ Все эксперименты с животными выполнялись в соответствии с законодательством Российской Федерации и Директивой европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях от 22 сентября 2010 г. № 2010/63/ес. ФИНАНСИРОВАНИЕ Исследование проведено по теме научно- исследовательской работы в рамках выполнения отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на период 2021-2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории российской федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней». КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ЛИТЕРАТУРА
|
