Цитохромы Р450 как инструменты электроферментативного синтеза

П.И. Королёва*, А.А. Гилеп, В.В. Шумянцева

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича,
119121, Москва, ул. Погодинская, 10; *e-mail: polinakoroleva1996@gmail.com

Ключевые слова: цитохромы P450; электрокатализ

DOI: 10.18097/BMCRM00232

ВВЕДЕНИЕ

Цитохромы P450 – суперсемейство ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз, выполняющих монооксигеназную функцию [1]. Основной функцией данных ферментов является биотрансформация эндогенных и экзогенных липофильных веществ. Цитохромы P450, обнаруженные во всех видах живых существ, катализируют огромное разнообразие регио- и стереоспецифических химических реакций, что делает эти ферменты перспективными для использования в качестве инструментов электроферментативного синтеза, а также для детоксификации ксенобиотиков [2, 3].

Цитохром Р450 2С9 (CYP2C9) – один из основных изоферментов цитохрома Р450 в организме человека, отвечающий за биотрансформацию лекарственных препаратов. К препаратам, метаболизируемым CYP2C9, относятся такие значимые лекарственные препараты, как диклофенак, S-варфарин, ибупрофен, напроксен и т.д. [4].

В клетке и в реконструированных системах для работы цитохрома Р450 необходимы белки редокс-партнёры, поэтому перспективным является исследование свойств цитохрома Р450 в электрохимических системах, где источником электронов является электрод. Поскольку каталитический цикл цитохрома P450 является сложным и многостадийным, на первой стадии которого осуществляется присоединение субстрата [5], более длительное взаимодействие фермента и субстрата на электроде способствует увеличению эффективности электрокаталитического процесса.

С целью повышения эффективности электрокаталитических параметров цитохром Р450 2С9-систем в данной работе предложен подход, моделирующий микросомальный путь электрон-транспортного механизма переноса электронов и использующий в качестве низкомолекулярной модели редуктазы, как белка редокс-партнёра, флавиновых кофакторов (флавинмононуклеотида (FMN), флавинадениндинуклеотида (FAD)) [6].

МЕТОДИКА

Электрохимические измерения проводили с использованием потенциостата PGSTAT 12 Autolab, («Metrohm Autolab Ins.», Нидерланды) с программным обеспечением GPES, (версия 4.9.7) и PGSTAT 312N Autolab с программным обеспечением NOVA (версия 2.0). В работе использовали трёхконтактные электроды, получаемые методом трафаретной печати (ПГЭ) («КолорЭлектроникс», Россия) с графитовыми рабочим и вспомогательным электродами и хлоридсеребряным электродом сравнения. Диаметр рабочего электрода составлял 0.2 см (площадь 0.0314 см²). Все потенциалы приведены относительно хлоридсеребряного электрода сравнения (отн. Ag/AgCl).

В работе были использованы следующие реактивы: гидроксид калия, дигидрофосфат калия, хлорид натрия (“Спектр-Хим”, Россия); дидодецилдиметиламмония бромид (ДДАБ), диклофенак натрия, хлороформ (“Sigma-Aldrich”, США); флавинаденинмононуклеотид (FMN) (“Фармстандарт”, Россия); флавинадениндинуклеотид (FAD) (“Fluka”, Швейцария); водную дисперсию 0.2% одностеночных углеродных нанотрубок (диаметр 1.6±0.4 нм, длина ≥5 мкм, площадь поверхности 1000 м²/г), стабилизированных карбоксиметилцеллюлозой TUBALL™ BATT H2O (“OCSIAL”, Россия).

Рекомбинантный CYP2С9 (210 мкМ) в 550 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7.2), содержащем 0.2% CHAPS, 1 мМ дитиотреитол и 20% глицерин (по объёму), получен и выделен по методике [7]. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически по образованию комплекса восстановленной формы гемопротеина с монооксидом углерода; коэффициент поглощения ε_450-490 = 91 мМ^-1см^-1 [8].

Для модификации ПГЭ на рабочую поверхность электрода наносили 1 мкл 0.1 М ДДАБ в хлороформе, после испарения хлороформа на электрод наносили 1 мкл 210 мкМ CYP2С9.

Для иммобилизации нековалентного комплекса CYP2С9 c FMN или FAD растворы флавиновых нуклеотидов и CYP2С9 смешивали в эквимолярных концентрациях, инкубировали 5 мин и наносили на поверхность ПГЭ, модифицированную ДДАБ (ПГЭ/ДДАБ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Увеличение каталитических параметров взаимодействия цитохрома P450 2C9 и субстрата путём образования эффективного фермент-субстратного комплекса

Первым шагом к увеличению эффективности электрокатализа цитохромов P450 является взаимодействие фермента с субстратом и образование фермент-субстратного комплекса между иммобилизованным ферментом и субстратом. Ранее нами было установлено, что предварительная инкубация ферментного электрода в буфере, содержащем субстрат, увеличивает эффективность электрокаталитической реакции в 1.46 раза, а также показана зависимость каталитического тока взаимодействия фермента с субстратом от времени образования фермент-субстратного комплекса на электроде [6]. На рисунке 1А представлены циклические вольтамперограммы ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9/FMN в присутствии 100 мкМ диклофенака после прединкубации. Сравнительная диаграмма величин каталитического тока от времени прединкубации представлена на рисунке 1Б.

Этап предварительного образования фермент-субстратного комплекса способствует увеличению каталитического тока цитохрома CYP2C9 в присутствии диклофенака, оптимальное время прединкубации – 30 мин.

Повышение эффективности каталитического процесса путём использования цитохрома P450 2C9 в комплексе с FAD и FMN как низкомолекулярными моделями NADPH-зависимой цитохром P450 редуктазы

Как было отмечено ранее [6], иммобилизация на электроде нековалентного комплекса цитохрома P450 и флавиновых нуклеотидов способствует увеличению электрохимических параметров взаимодействия. В данной работе был исследован нековалентный комплекс цитохрома P450 2С9 с FAD и FMN.

На рисунке 2 представлены циклические вольтамперограммы ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9 и ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9/FAD.

Согласно вольтамперограммам были рассчитаны электрохимические параметры для систем ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9, ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9/FAD. Потенциал восстановления в этих системах существенно не отличается и равен E_red = -0.425±0.005 В и E_red = -0.420±0.008 В соответственно. При добавлении диклофенака в систему потенциал катализа смещался в положительную область потенциалов и соответствовал значениям E_cat = -0.402±0.017 В для ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9 и E_cat = -0.407±0.007 для ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9/FAD. Также было рассчитано соотношение каталитического тока в присутствии диклофенака к току восстановления в присутствии кислорода. Оно составило 1.35 для системы ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9/FAD и 1.14 для ПГЭ/ДДАБ/CYP2C9, что также говорит о большей эффективности системы с флавиновым кофактором.

В данной работе для исследования электрокаталитических свойств цитохрома CYP2C9 и комплексов цитохром CYP2C9/FAD и цитохром CYP2C9/FMN была использована двухэлектродная система, состоящая из ферментативного электрода-катализатора, модифицированного мембраноподобным соединением дидодецилдиметиламмоний бромидом (ПГЭ/ДДАБ), и измерительного электрода, модифицированного углеродными нанотрубками (ПГЭ/УНТ). Для исследования эффективности электроферментативных реакций, катализируемых цитохромом CYP2C9, в качестве субстрата был использован нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат диклофенак. CYP2C9 катализирует реакцию стереоспецифического гидроксилирования с образованием 4’-гидроксидиклофенака. Метаболит 4’-гидроксидиклофенак регистрировали с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии при потенциале Е = 0.12 (отн. Ag/AgCl) [9].

Использование FAD и FMN, как низкомолекулярного медиатора, позволило увеличить эффективность электрокатализа системы ПГЭ/ДДАБ/CYP2С9/FAD до 148±10% и ПГЭ/ДДАБ/CYP2С9/FMN до 113±6% по сравнению с ПГЭ/ДДАБ/CYP2С9 (100±5%), а также увеличить скорость ферментативной реакции в 1.5 и 1.13 раза соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе были разработаны электрохимические системы на основе нековалентных комплексов CYP2C9 с флавиновыми кофакторами. Показано, что использование FAD и FMN в качестве низкомолекулярных моделей NADPH-зависимой цитохром P450 редуктазы способствует увеличению эффективности электрокатализа.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Работа не связана с исследованиями, в которых в качестве объекта выступают люди или животные.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы) (№ 122030100168-2).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Guengerich, F.P. (2015) Human cytochrome P450 enzymes. In: Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (de Montellano O.P.R., ed.). Springer, N. Y., pp. 523–785.
2. Zuccarello, L., Barbosa, C., Todorovic, S., Selivera, C.M. (2021) Electrocatalysis by heme enzymes-applications in biosensing. Catalysts, 11(2), 218. DOI
3. Bernhardt, R., Urlacher, V.B. (2014) Cytochromes P450 as promising catalysts for biotechnological application: Chances and limitations. Appl. Microbiol. Biotechnol., 98(14), 6185–6203. DOI
4. Shumyantseva, V.V., Bulko, T.V., Koroleva, P.I., Shikh, E.V., Makhova, A.A., Kisel, M.S., Haidukevich, I.V., Gilep, A.A. (2022) Human cytochrome P450 2C9 and its polymorphic modifications: Electroanalysis, catalytic properties, and approaches to the regulation of enzymatic activity. Processes, 10, 383. DOI
5. Denisov, I.G., Makris, T.M., Sligar, S.G., Schlichting, I. (2005) Structure and chemistry of cytochrome P450. Chem. Rev., 105(6), 2253–2278. DOI
6. Shumyantseva V.V., Koroleva P.I., Bulko T.V., Shkel T.V., Gilep A.A., Veselovsky A.V. (2023) Approaches for increasing the electrocatalitic efficiency of cytochrome P450 3A4. Bioelectrochemistry, 149, 108277. DOI
7. Gilep, A.A., Guryev, O.V., Usanov, S.A., Estabrook, R.W. (2001) Reconstitution of the enzymatic activities of cytochrome P450s using recombinant flavocytochromes containing rat cytochrome b(5) fused to NADPHcytochrome P450 reductase with various membrane-binding segments. Arch. Biochem. Biophys., 390(2), 215–221. DOI
8. Omura, T., Sato, R. (1964) The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes: II. Solubilization, purification, and properties. J. Biol. Chem., 239(7), 2379–2385.
9. Kuzikov, A.V., Filippova, T.A., Masamrekh, R.A., Shumyantseva, V.V. (2022) Electroanalysis of 4′-hydroxydiclofenac for CYP2C9 enzymatic assay. Electrocatalysis, 13(5), 630–640. DOI