АССОЦИАЦИЯ NADPH–ОКСИДАЗЫ 2 (NOX2) С РАЗВИТИЕМ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

Б.Р. Ибрагимов ¹*, А.С.Демерцидис ¹, И.Д.Решетникова ^1,2,  Ю.В. Скибо ¹,  С.Н. Абрамов¹, З.И.Абрамова¹

¹Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская 18; *e-mail: Ibragimov94@inbox.ru
²Казанский научно–исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, Казань

Ключевые слова: NOX2; NADPH–оксидаза 2; LС3–ассоциированный фагоцитоз; моноциты, атопическая бронхиальная астма

DOI: 10.18097/BMCRM00272

ВВЕДЕНИЕ

NADPH–оксидаза 2 (NOX2) представляет собой ключевой компонент иммунной системы, обеспечивающий защиту организма путем выработки активных форм кислорода (АФК): супероксид аниона (O₂^•−), гидроксильного радикала (^•OH), пероксида водорода (H₂O₂) [1]. NOX2 экспрессируется преимущественно в нейтрофилах, моноцитах и макрофагах. Она участвует в процессах хемотаксиса (привлечения лейкоцитов к месту повреждения или инфекции), LC3–ассоциированного фагоцитоза (поглощения и уничтожения инфекционных агентов) и индуцировании респираторного взрыва (резкого увеличения уровня АФК в ответ на бактериальную или грибковую инфекцию). Именно эта способность NOX2  производить АФК лежит в основе процесса LC3–ассоциированного фагоцитоза (LAP) [2, 3]. На начальной стадии созревания фагосомы в ответ на соответствующие сигнальные события, такие как передача сигналов, от рецепторов FcγR и TLR, собирается активный комплекс NADPH-оксидазы, который обеспечивает выработку реакционноспособных видов кислорода (АФК) непосредственно внутри везикулы. Внутри фагосомы АФК продуцируются комплексом NADPH -оксидазы. Rubicon стабилизирует комплекс посредством взаимодействия с p22phox, в то время как p40phox взаимодействует с фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI(3)P) для привлечения остальных компонентов. Одновременно цитозольный LC3 подвергается модификации с помощью специального конъюгационного аппарата, приводящего к формированию LC3-II на поверхности фагосомальной мембраны [3]. Вскоре после того, как LC3 соединяется с мембраной фагосомы, образовавшаяся структура быстро сливается с лизосомами, обеспечивая быструю очистку от захваченного материала. Отсутствие эффективного LC3–ассоциированного фагоцитоза (LAP) приводит к нарушению контроля над проникшими патогенами и запускает значительное увеличение продукции провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 и IL-1β [4, 5].

Несмотря на важные защитные функции, повышенная экспрессия NOX2 негативно сказывается на организме, вызывая ряд неблагоприятных эффектов. [6]. Путём активации сигнальных путей (MAPK, NF-κB, PI3K/Akt) NOX2 стимулирует выделение провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α, IL-1β), усиливая воспаление и способствуя хронизации патологического процесса. Эти цитокины усиливают воспаление, привлекая дополнительные иммунные клетки к очагу поражения и обеспечивая дальнейшее распространение воспалительного процесса [7]. Помимо стимуляции выделения провоспалительных цитокинов, повышенная продукция АФК, вызванная активностью NOX2, нарушает механизм LC3–ассоциированного фагоцитоза (LAP). Избыточная продукция АФК подавляет синтез фосфатидилинозитол-3-фосфата (PI(3)P), нарушая нормальный ход образования мембранной оболочки. PI(3)P необходим для привлечения ATG16L1/ATG5 комплекса, который формирует мембрану вокруг частиц-мишеней, инициируя дальнейшее протекание процесса LAP. Таким образом, NOX2 влияет на активность LC3 именно через изменение концентрации PI(3)P [8].

Астма является распространенным хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей. Наличие астмы имеет тенденцию к увеличению выработки активных форм кислорода (АФК), а антиоксидантная система в легких недостаточна для его смягчения. Повышенный уровень АФК может вызывать вредные патофизиологические нарушения астмы [1, 9, 10].

Большинство имеющихся публикаций сосредоточено на общих аспектах окислительного стресса и значении отдельных метаболитов АФК в воспалительном процессе дыхательных путей [11-14].

Целью настоящей работы было установление ассоциации NOX2 с отягощенностью протекания атопической бронхиальной астмы (АБА).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика исследуемых групп

Объектом исследования были моноциты, выделенные из фракции лейкоцитов. Образцы фракции лейкоцитов здоровых доноров и пациентов с атопической бронхиальной астмой были предоставлены Казанским научно–исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии.

Все пациенты находились под наблюдением врачей и не получали медикаментозного лечения во время проведения исследований. Здоровые доноры и пациенты с поставленным диагнозом проживают на территории Республики Татарстан. Каждая степень тяжести характеризовалась своими особенностями течения заболевания и симптоматики. Диагноз атопической бронхиальной астмы устанавливался врачом-пульмонологом на основании клинической картины, истории болезни и соответствующих лабораторных тестов. Постановка диагноза и оценка её степени тяжести осуществлялась на основе критериев, указанных в клинических рекомендациях Global Initiative for Asthma (GINA) [15].

Группа контроля (здоровые участники) включала 15 человек в возрасте от 25 до 32 лет включительно.

Для пациентов с лёгкой персистирующей формой аллергической бронхиальной астмы (АБА) характерны редкие эпизоды одышки, возникающие приблизительно один раз в месяц, и только в дневное время. Приступы имели лёгкий характер и легко устранялись самостоятельно либо после единичного приёма бронхолитического препарата (ингаляционного или перорального). Группа пациентов с лёгкой АБА включала 15 человек в возрасте от 29 до 35 лет включительно.

Для пациентов со средней персистирующей формой АБА характерны учащенные приступы одышки, возникающие чаще одного раза в неделю, но реже одного раза в сутки. Эпизоды сопровождались изменениями дыхательной функции и требовали однократного приёма бронхолитика и/или внутривенного введения глюкокортикоидов. Группа пациентов со среднетяжёлым течением АБА включала 15 человек в возрасте от 33 до 40 лет включительно.

Для пациентов с тяжелой формой АБА характерны ежедневные симптомы и частые обострения, включая ночные приступы одышки. Приступы протекают тяжело и требуют комплексного подхода к лечению, включающего парентеральное введение бронхолитиков в сочетании с глюкокортикоидными препаратами. Группу пациентов с тяжелой АБА составляли 16 человек в возрасте от 25 до 68 лет.  Заболевание значительно ограничивает физическую активность и нарушает сон пациента.

Выделение моноцитов

Выделение моноцитов проводили в два этапа: на первом этапе выделяли общую фракцию лейкоцитов методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (ρ = 1.077 г/мл), («ПанЭко», Россия); на втором этапе проводили обогащение фракции моноцитов методом адгезии [16]. На сегодняшний день для обогащения фракции моноцитов используют несколько основных подходов, отличающихся друг от друга по степени обогащения и жизнеспособности клеток. Среди них: метод обогащения путем адгезии к пластику, метод центрифугирования на градиенте перколла и метод магнитной сепарации с позитивной или негативной селекцией клеток. Однако обогащение методом адгезии является более доступным из указанных вариантов [17].

Обогащение методом адгезии проводили путем культивирования в среде RPMI в течение 2 ч при 37°C и 5% CO₂. Не прикрепившиеся клетки отделяли путем удаления надосадочной жидкости, а прикрепившиеся клетки (моноциты) трижды промывали фосфатно–солевым буфером (таблетки фосфатно–солевого буфера, рН 7.4, «ПанЭко») [16].

Степень чистоты моноцитов определяли путем окрашивания суспензии клеток моноклональными антителами к мембранному рецептору CD14, конъюгированными с флуоресцеин изотиоцианатом (FITC Anti–human CD14, «BioLegend», США).

Определение уровня АФК

АФК определяли в моноцитах здоровых доноров и пациентов с атопической бронхиальной астмой методом проточной цитометрии c использованием DHR–123, адаптированным из ранее опубликованных работ  [18-34]. Метод DHR–123 был оптимизирован для обеспечения максимально возможного сигнала флуоресценции, обнаруживаемого в образцах с наибольшей величиной разницы между положительными и отрицательными контролями.

Исходный раствор DHR–123 (Dihydrorhodamine–123, «Sigma–Aldrich», США, 5.0 мг DHR–123 в 1.0 мл диметилсульфоксида (DMSO), «Евроген», Россия) хранили в аликвотах по 50 мкл при температуре −70°C. Перед проведением анализа 1 мкл исходного раствора разводили в 99 мкл фосфатно–солевого буфера. Для окрашивания одного образца использовали 20 мкл полученного раствора DHR–123 (50 мкг/мл), что составляет 1 мкг красителя на 100 мкл суспензии клеток (5×10⁵ клеток), или конечный раствор с концентрации 10 мкг/мл [10].

Форбол–12–миристат–13–ацетат (PMA, Phorbol 12–myristate 13–acetate, Sigma–Aldrich, США) растворяли в DMSO. Далее 1 мкл из полученного раствора (1мг/мл) разводили в 199 мкл фосфатно–солевого буфера (раствор с концентрацией 5 мкг/мл). Для положительного контроля одного образца использовали 20 мкл раствора PMA, что составляет 0.1 мкг активатора на стимуляцию 100 мкл суспензии клеток (5×10⁵ клеток).

Перед началом анализа клетки инкубировали 10 мин на льду. При анализе на каждый образец использовали две пробы: в качестве отрицательного контроля использовали образец, инкубированный только с DHR–123; в качестве положительного контроля использовали образец, инкубированный с PMA и DHR–123. В первую пробирку FACS или эппендорф (отрицательный контроль) добавляли 20 мкл фосфатно–солевого буфера. Во вторую пробирку (положительный контроль) добавляли 20 мкл PMA (5 мкг/мл – 0.1 мкг на образец). Образцы вортексировали и инкубировали на водяной бане в течение 10 мин при 37 °C. Затем добавляли 20 мкл DHR–123 (50 мкг/мл – 1 мкг на образец) и клетки инкубировали в течение ещё 10 мин. Общее время инкубации составило 20 мин при 37°С на водяной бане в темноте. Затем образцы центрифугировали при 11000 g, а супернатант удаляли. Далее к образцам добавляли фосфатно–солевой буфер (PBS) и промывали клетки центрифугированием.

Окислительное превращение дигидрородамина–123 (DHR–123) во флуоресцентный родамин–123 (Rho-123) определяли на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). Флуоресценция Rho-123, возникающая при окислении DHR–123, детектируется на канале FL1 (525 нм).

Анализ медианы и геометрического среднего (gMean) интенсивности флуоресценции родамина–123 (Rho–123) проводили в программе FLOWJO согласно указанным протоколам [18, 27, 31].

Определение уровня экспрессии гена NOX2

Анализ уровня экспрессии гена NOX2 в моноцитах здоровых доноров и пациентов с атопической бронхиальной астмой проводили методом ОТ–ПЦР. Выделение РНК проводили фенол–хлороформным методом с использованием коммерческого реагента для выделения суммарной РНК из биологических образцов ExtractRNA («Евроген») согласно инструкции производителя. К клеткам добавляли 1 мл ExtractRNA, с последующим пипетированием и тщательным перемешиванием с помощью вортекса. Далее клетки лизировали при комнатной температуре в течение 10 мин, для полной диссоциации нуклеопротеидных комплексов. Затем центрифугировали лизат в течение 10 мин при 11000 g при комнатной температуре. Не касаясь осадка, аккуратно переносили супернатант в новую пробирку. К супернатанту добавляли 0.2 мл хлороформа, с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 11000 g при комнатной температуре. В ходе центрифугирования происходило разделение смеси на три фазы: нижнюю – органическую фенол–хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу содержащую РНК. Водную фазу отбирали под наклоном пробирки 45°, не касаясь интерфазы. К водной фазе добавляли 0.5 мл хлороформа с повторным центрифугированием в течение 10 мин при 11000 g при комнатной температуре. Далее верхнюю водную фазу переносили в чистую пробирку; добавляя 0.5 мл 100% изопропанола, с аналогичным центрифугированием при тех же условиях. Супернатант отбирали, оставляя осадок РНК на дне пробирки, к которому затем добавляли 1 мл 80% этанола. Пробирку центрифугировали в течение 5 мин при 11000 g при комнатной температуре, с последующим удалением супернатанта. Осадок высушивали при комнатной температуре в течение 5–7 мин или в термостате при 60–65°С в течение 1–2 мин. К осадку РНК добавляли воду, свободную от нуклеаз, в необходимом объеме. Для улучшения растворения образец прогревали при 55– 60°С в течение 3–5 мин.

Синтез кДНК из полученной матрицы РНК проводили с использованием коммерческого комплекта реагентов Реверта–L согласно инструкции производителя («АмплиСенс», Россия). Для этого готовили реакционную смесь на 12 реакций. В пробирку RT–mix вносили 5 мкл RT–mix–1, к полученному раствору добавляли 6 мкл ревертазы (MMlv). Вносили в микропробирки по 10 мкл полученной реакционной смеси. Затем к реакционной смеси добавляли по 10 мкл РНК–пробы.

Далее проводили обратную транскрипцию в термостате (Драй–блок Biosan TDB–120, «Biosan», Латвия) при температуре 37°С в течение 30 мин. Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК разводили ДНК–буфером в два раза для последующей постановки ПЦР (к 20 мкл кДНК добавляли 20 мкл ДНК–буфера).

Для проведения ПЦР использовали следующие компоненты реакционной смеси: 10X Taq Turbo буфер в объеме 2.5 мкл («Евроген»), dNTPs 50x (10мM) в объеме 0.5 мкл («Евроген»), Taq ДНК–полимераза в объеме 0.5 мкл («Евроген»), интеркалирующий краситель SYBR Green I 50x в объеме 0.5 мкл («Евроген»), DMSO в объеме 1 мкл («Евроген»), комплементарная ДНК матрица (1–100 нг на реакцию), прямой праймер NOX2 в объеме 1 мкл, обратный праймер NOX2 в объеме 1 мкл, до конечного объема 25 мкл реакционной смеси доводили H₂O («Евроген»). Аналогичные реакционные смеси готовили для референсного гена B2M.

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 1. Праймеры, используемые при ОТ–ПЦР для определения уровня экспрессии гена NOX2 в моноцитах здоровых доноров и пациентов с атопической бронхиальной астмой.

Полимерзно-цепную реакцию проводили на приборе CFX96 (CFX96 Touch Real–Time PCR Detection System, «Bio–Rad», США), с использованием следующих режимов: предварительная денатурация 1 цикл при 93°С в течение 3 мин; денатурация /отжиг /элонгация  до 40 циклов: денатурация при 93°С в течение 15 с, отжиг праймеров при 61°С в течение 20 с, элонгация (визуализация) при 72°С в течение 30 с на 1 т.п.о. [35].

Расчёт экспрессии гена NOX2 проводили при помощи анализа порогового цикла с использованием эталонного гена B2M по методу  ∆∆CT  [35, 36].

Статистический анализ

Нормальность распределения полученных данных проверяли критериями Колмогорова-Смирнова и Лиллиефорса, а также критерием Шапиро-Уилка. Для сравнения трех или более групп с нормальным распределением использовали однофакторный дисперсионный анализ с критерием Тьюки. Значение p<0.05 считали значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение моноцитов из фракции лейкоцитов является распространенным способом получения очищенных моноцитов для исследований in vitro. На первом этапе исследования методом разделения в градиенте плотности фиколла (ρ = 1.077 г/мл) была получена фракция лейкоцитов с процентным соотношением моноцитов от 5.23 % до 6.21 %, так же наблюдалось повышенное соотношение моноцитов 14.8%. Методом адгезии были получены фракции моноцитов с процентным соотношением 74.1%. Наличие белка CD14, показанное методом проточной цитометрии подтвердило, что полученная фракция содержит моноциты (рис. 1).

Стимуляция PMA вызывала значительное увеличение флуоресценции родамина во всех исследуемых группах (рис. 2: A.1., Б.1., В.1., Г.1.). Базальные уровни флуоресценции (левые части рисунков A.1., Б.1., В.1., Г.1.) демонстрировали низкие уровни генерации АФК в покоящихся клетках, тогда как стимулированные PMA клетки проявляли резкое увеличение флуоресценции (правые части рисунков A.1., Б.1., В.1., Г.1.), свидетельствующее о высокой способности моноцитов реагировать активным дыхательным взрывом на внешние раздражители.

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении функциональной активности моноцитов у пациентов, несмотря на индивидуальные вариации базальных и индуцированных уровней активности. Высокая чувствительность моноцитов к стимулу PMA подчёркивает значимость мониторинга их функций при оценке эффективности противовоспалительной терапии и рисков обострения заболеваний.

Анализ интенсивности флуоресценции Rho–123 в моноцитах выявил значительные различия между группами пациентов с различной степенью тяжести атопической бронхиальной астмы (АБА) и контрольной группой здоровых доноров.

Медианное значение флуоресценции канала (FL1) в группе здоровых доноров (контроль) составило 66.46 ± 14.56, тогда как для легкой БА – 119.36 ±19.24, для средней БА – 191.84±21.99, а для группы пациентов с тяжелой БА – 440 ± 153.17 (рис. 3.А.1.) Геометрическое среднее флуоресценции в группе здоровых доноров  – 73.5±14.38, в группе пациентов с легкой БА – 134.44±24.7717; в группе пациентов со средней БА – 212.33±28.57; в группе тяжелой БА – 447.50± 146.79 (рис. 3.А.2.).

Обнаружено значимое увеличение медианы флуоресценции Rho–123 в группе пациентов с тяжёлой формой АБА по сравнению с группой здоровых доноров и пациентами с лёгкой степенью АБА, а также по сравнению с группой пациентов со средней степенью АБА (p<0.001).

Геометрическое среднее интенсивности флуоресценции Rho–123 пациентов со средней степенью АБА было повышено по отношению к контрольной группе (p<0.05), а также меньше по отношению к группе с тяжелой степенью АБА (p<0.001). У пациентов с тяжёлой формой АБА выявлен значимый рост геометрического среднего интенсивности флуоресценции по сравнению со всеми исследуемыми группами (p<0.001): контрольная группа, лёгкая форма АБА и средняя форма АБА.

Эти данные свидетельствуют в пользу того, что тяжесть заболевания коррелирует с увеличением активности моноцитов, что может быть связано с усилением воспалительных процессов и окислительного стресса.

На следующем этапе исследования методом ОТ–ПЦР были определены уровни экспрессии гена NOX2  (рис. 4).

Анализ экспрессии гена NOX2 в моноцитах выявил значительные различия между группами пациентов с различной степенью тяжести атопической бронхиальной астмы (АБА) и контрольной группой здоровых доноров.

В моноцитах здоровых доноров (контроль) относительный уровень экспрессии NOX2 составил 0.177379± 0.096110, в группе с легкой АБА – 0.621562±0.075649, в группе со средней АБА – 0.836449±0.077394, в группе с тяжелой астмой – 1.483824± 0.411264. При этом выявлено статистически значимое повышение экспрессии гена NOX2 у пациентов со средней и тяжёлой степенью АБА по сравнению с пациентами остальных групп: среднее значение показателя в группе средней степени значимо отличалось от контроля, группы лёгкой степени и группы тяжёлой степени; аналогично, показатель в группе тяжёлой степени был выше значений контрольной группы, группы лёгкой степени и группы средней степени (p<0.001).

Результаты свидетельствуют о том, что тяжесть заболевания коррелирует с увеличением экспрессии NOX2, что может быть связано с усилением воспалительных процессов и окислительного стресса.

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашей работе было обнаружено PMA-зависимое увеличение продукции АФК моноцитами больных АБА с увеличением отягощенности степени тяжести заболевания (рис. 2, 3). Повышенный уровень АФК вызывает усиление окислительного стресса и нарушение процессов аутофагии, что ведет к ухудшению состояния пациентов. Окислительный стресс усиливается при тяжелой астме и во время обострений, что в свою очередь приводит к воспалению и гиперреактивности дыхательных путей. Повышенная экспрессия гена NOX2, показанная методом ОТ–ПЦР (рис. 4), в моноцитах пациентов с астмой может способствовать этому явлению.

Ранее нами [37] было установлено снижение экспрессии белка Rubicon в моноцитах пациентов с астмой тяжелой формы, в том числе нарушение протекания LC3–ассоциированного фагоцитоза. С учетом того, что белок Rubicon взаимодействует с компонентами комплекса NOX2, поддерживая стабильность и функциональную активность этого ферментативного комплекса [38], низкая экспрессия белка Rubicon и гиперэкспрессия NOX дополнительно усугубляют воспалительные процессы и повышают риски развития серьезных патологических изменений.

В совокупности полученные данные позволяют предположить, что гиперэкспрессия NOX2 отрицательно влияет на LC3-ассоциированный фагоцитоз (LAP), снижая возможности ликвидации патогенов и ослабляя общую иммунокомпетенцию.

Представленные результаты обосновывают необходимость разработки терапевтических стратегий, ориентированных на регулирование активности NOX2 и оптимизацию контроля воспалительных процессов. Такие подходы включают применение антиоксидантов и ингибиторов NOX2 для уменьшения уровней АФК, использование препаратов, нормализующих активность LC3-ассоциированного фагоцитоза (например, аналогов АТФ и модуляторов NF-κB), а также совершенствование представлений о взаимодействии NOX2 с другими сигнальными каскадами для создания таргетных лекарственных средств.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Исследование было проведено в полном соответствии с действующими этическими стандартами и принципами биоэтики. Все использованные образцы (фракции лейкоцитов) были предоставлены Казанским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии. Исследование выполняли согласно внутренним правилам и процедурам института, включая требования к безопасности и конфиденциальности данных. Все процедуры проводили в строгом соответствии с нормативными актами и регламентами, регулирующими проведение научных исследований в области биологии и медицины в Российской Федерации.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках программы «Стратегическое академическое лидерство Казанского федерального университета» (ПРИОРИТЕТ-2030).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

ЛИТЕРАТУРА

1. Mak, J.C., Leung, H.C., Ho, S.P., Law, K.W.B., Lam, W.K., Tsang, K.W.T., Ip,M.S.M., Chan–Yeung, M. (2004) Systemic oxidative and antioxidative status inChinese patients with asthma. J. Allergy Clin. Immunol., 114(2), 260–264. DOI
2. Sweet, M.J., Ramnath, D., Singhal, A., Kapetanovic, R. (2024) Inducibleantibacterial responses in macrophages. Nature Reviews Immunology, 25(2),92-107. DOI
3. Ibragimov, B.R., Skibo, Yu.V., Abramova, Z.I. (2023) Autophagy and LC3–associated phagocytosis: similarities and differences. Medical Immunology(Russia), 25(2), 233–252. DOI
4. Kim, B.H., Shenoy, A.R., Kumar, P. (2011) A family of IFN-gamma-inducible65-kD GTPases protects against bacterial infection. Science, 332(6030),717–721. DOI
5. Matsunaga, K., Saitoh, T., Tabata, K., Omori, H., Satoh, T., Kurotori, N.,Maejima, I., Shirahama-Noda, K., Ichimura, T., Isobe T., Akira, S., Noda, T.,Yoshimori, T. (2009) Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon,reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell Biol., 11(4),385–396. DOI
6. Qu, J., Li, Y., Zhong, W., Gao, P, Hu, C.J. (2002) Recent developments in therole of reactive oxygen species in allergic, asthma. J. Thorac. Dis., 9(1), E32–E43. DOI
7. Michaeloudes, C., Abubakar–Waziri, H., Lakhdar, R., Raby, K., Dixey,P., Adcock, I.M., Mumby, S., Bhavsar, P.K., Chung, K.F. (2022) Molecularmechanisms of oxidative stress in asthma. Molecular Aspects of Medicine, 85,e101026. DOI
8. Ravikumar, B., Moreau, K., Jahreiss, L., Puri, C., Rubinsztein, D.C. (2010)Plasma membrane contributes to the formation of pre-autophagosomalstructures. Nature Cell Biology, 12(8), 747-757. DOI
9. Ammar, M., Bahloul, N., Amri, O., Omri, R., Ghozzi, H., Kammoun, S.,Zeghal, K., Mahmoud, L.B. (2022) Oxidative stress in patients with asthma andits relation to uncontrolled asthma. J. Clin. Lab. Anal., 36(5), e24345. DOI
10. Karadogan, B., Beyaz, S., Gelincik, A., Buyukozturk, S., Arda, N. (2022)Evaluation of oxidative stress biomarkers and antioxidant parameters inallergic asthma patients with different level of asthma control. J. Asthma, 59(4),663–672. DOI
11. Nadeem, A., Chhabra, S.K., Masood, A., Raj, H.G. (2003) Increasedoxidative stress and altered levels of antioxidants in asthma. J. Allergy Clin.Immunol., 111(1), 72–78. DOI
12. Asrar, A., Shameem, M., Husain, Q. (2012) Relation of oxidant antioxidantimbalance with disease progression in patients with asthma. Ann. Thorac Med.,7(4), 226–232. DOI
13. Anes, A.B., Nasr, H.B., Fetoui, H., Bchir, S., Chahdoura, H., Yacoub, S.,Garrouch, A., Benzarti, M., Tabka, Z., Chahed, K. (2015) Alteration in systemicmarkers of oxidative and antioxidative status in Tunisian patients with asthma:relationships with clinical severity and airflow limitation. J. of Asthma, 53(3),227–237. DOI
14. Asare, P.F., Hurtado, P.R., Tran, H.B., Perkins, G.B., Roscioli, E., Hodge,S. (2023) Reduction in Rubicon by cigarette smoke is associated with impairedphagocytosis and occurs through lysosomal degradation pathway. Clinical andExperimental Medicine, 23(7), 4041–4055. DOI
15. Levy, M.L., Bacharier, L.B., Bateman, E., Boulet, L.P., Brightling, C., Buhl,R., Brusselle, G., Cruz, A.A., Drazen, J.M., Duijts, L., Fleming, L., Inoue, H.,Ko, F.W.S., Krishnan, J.A., Mortimer, K., Pitrez, P.M., Sheikh, A., Yorgancıoğlu,A., Reddel, H.K. (2023) Key recommendations for primary care from the 2022Global Initiative for Asthma (GINA) update. N.P.J. Prim. Care Respir. Med.,33(1), 7. DOI
16. Gassan, D.A., Kotova, O.O., Naumov, D.E., Sugaylo, I.Yu., Gorchakova,Y.G., Sinyuk, A.A. (2020) Comparative characteristics of monocytes isolationconditions by adhesion method for in vitro experiments. Bulletin Physiologyand Pathology of Respiration, 78, 128-134. DOI
17. Treves, A.J., Yagoda, D., Haimovitz, A., Ramu, N., Rachmilewitz, D., Fuks,Z. (1980) The isolation and purification of human peripheral blood monocytesin cell suspension. J. Immunol., 39(2), 71–80. DOI
18. Yang, Y., Zhang, G., Yang, T., Gan, J., Xu, L., Yang, H. (2018) A flow–cytometry–based protocol for detection of mitochondrial ROS production underhypoxia. Star Protocols, 2(2), e100466. DOI
19. Assing, K., Laursen, C.B., Campbell, A.J., Beck, H.C., Davidsen, J.R. (2024)Proteome and dihydrorhodamine profiling of bronchoalveolar lavage in patientswith chronic pulmonary aspergillosis. J. Fungi, 10(5), 314. DOI
20. Richardson, M.P., Ayliffe, M.J., Helbert, M., Davies, E.G. (1998) A simpleflow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of theneutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitativenitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods, 219(1), 187–193. DOI
21. Pioch, J., Blomgran, R. (2022) Optimized flow cytometry protocol fordihydrorhodamine 123–based detection of reactive oxygen species in leukocytesubpopulations in whole blood. Journal of Immunological Methods, 507,e113308. DOI
22. Vernon, P.J., Schaub, L.J., Dallelucca, J.J., Pusateri, A.E., Sheppard, F.R.(2015) Rapid detection of neutrophil oxidative burst capacity is predictive ofwhole blood cytokine responses. PLoS One, 10(12), 663–672. DOI
23. Johnstone, A.M., Koh, A., Goldberg, M.B., Glogauer, M. (2007) Ahyperactive neutrophil phenotype in patients with refractory periodontitis. J.Periodontol., 78(9), 1788–1794. DOI
24. Siddiqi, M., Garcia, Z.C., Stein, D.S., Denny, T.N., Spolarics, Z. (2001)Relationship between oxidative burst activity and CD11b expression inneutrophils and monocytes from healthy individuals: Effects of race and gender.Cytometry, 46(4), 243–246. DOI
25. Bylund, J.J., Brown, K.L., Movitz, C., Dahlgren, C., Karlsson, A. (2010)Intracellular generation of superoxide by the phagocyte NADPH oxidase: how,where, and what for? Free Radic. Biol. Med., 49(12), 1834–1845. DOI
26. Kavianpour, M., Moradzadeh, K., Muhammadnejad, S., Jabbarpour, Z.,Khorsand, A.A., Aghayan, S., Vasei, M., Verdi, J. (2022) Flow cytometricmeasurement of reactive oxygen species to assess the effects of preconditioningtotal body irradiation on NOG mice. Asian Pac. J. Cancer Prev., 23(2), 383–382. DOI
27. Quach, A., Glowik, S., Putty, T., Ferrante, A. (2019) Delayed bloodprocessing leads to rapid deterioration in the measurement of the neutrophilrespiratory burst by the dihydrorhodamine–123 reduction assay. Cytometry BClin. Cytom., 96(5), 389–396. DOI
28. Chang, S.C., Rodrigues, N.P., Zurgil, N., Henderson, J.R., Bedioui, F.,McNeil, C.J., Deutsch, M. (2005) Simultaneous intra– and extracellularsuperoxide monitoring using an integrated optical and electrochemical sensorsystem. Biochem. Biophys. Res. Commun., 327(4), 979–984. DOI
29. Ghasemzadeh, M., Hosseini, E. (2017) Platelet granule release is associatedwith reactive oxygen species generation during platelet storage: A direct linkbetween platelet pro–inflammatory and oxidation states. Thromb. Res., 156(5),101–104. DOI
30. Vernon, P.J., Paredes, R.M., Sooter, A.J., Schaub, L.J., Grossman, H.M.,Pusateri, A.E., Glaser, J.J., Sheppard, F.R. (2016) Severe hemorrhagic shockinduces acute activation and expansion of IL–8+/IL–10+ neutrophils withenhanced oxidative reactivity in non–human primates. Shock, 46(3), 129–136. DOI
31. Hastuti, S.D., Quach, A., Costabile, M., Barton, M.D., Pyecroft, S.B.,Ferrante A. (2019) Measuring the Asian seabass (Lates calcarifer) neutrophilrespiratory burst activity by the dihydrorhodamine–123 reduction flowcytometry assay in whole blood. Fish Shellfish Immunol., 92(5), 871–880. DOI
32. Djiadeu, P., Azzouz, D., Khan, M.A., Kotra, L.P., Sweezey, N., Palaniyar, N.(2017) Ultraviolet irradiation increases green fluorescence of dihydrorhodamine(DHR–) 123: false–positive results for reactive oxygen species generation.Pharmacol. Res. Perspect., 5(2), e00303. DOI
33. Wardman, P. (2008) Methods to measure the reactivity of peroxynitrite–derived oxidants toward reduced fluoresceins and rhodamines. MethodsEnzymol., 441, 261–282. DOI
34. Vowells, S.J., Sekhsaria, S., Malech, H.L., Shalit, M., Fleisher, T.A. (1995)Flow cytometric analysis of the granulocyte respiratory burst: a comparisonstudy of fluorescent probes. J. Immunol. Methods, 178(1), 89–97. DOI
35. Tichopad, A., Dilger, M., Schwarz, G., Pfaffl, M.W. (2003) Standardizeddetermination of real–time PCR efficiency from a single reaction set–up.Nucleic Acids Res., 31(20), e122. DOI
36. Bantula, M, Arismendi, E., Picado, C., Mullol, J., Roca-Ferrer, J., Tubita,V. (2022) Reference Gene Validation for RT–qPCR in PBMCs from AsthmaticPatients with or without Obesity. Methods Protoc., 5(3), E35. DOI
37. Ibragimov, B.R., Skibo, Yu.V., Reshetnikova, I.D., Abramov, S.N., Daminova,A.G., Evtyugin, V.G., Abramova Z.I. (2024) Effect of the Rubicon protein onLC3-associated phagocytosis by monocytes in the patients with severe atopicbronchial asthma. Medical Immunology (Russia), 26(6), 1213–1222. DOI
38. Wong, S., Payel Sil, P., Martinez, J. (2017) Rubicon: LC3-associatedphagocytosis and beyond. The FEBS journal, 285(8), 1379-1388. DOI

К данной статье приложены дополнительные материалы, свободно доступные в электронной версии (http://dx.doi.org/10.18097/BMCRM00____________) на сайте журнала.