Усиление сигнала SPR биосенсора с помощью золотых наночастиц на примере анализа бета-2-микроглобулина человека

Ю.В. Мезенцев, О.В. Гнеденко, П.В. Ершов^*, А.С. Иванов

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича, 119121, Москва, Погодинская ул. 10;^*e-mail: pavel79@inbox.ru

Ключевые слова: поверхностный плазмонный резонанс; оптический биосенсор; усиление сигнала; золотые наночастицы; белок-белковые взаимодействия

DOI: 10.18097/BMCRM00053

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время появляются и быстро развиваются новые сенсорные технологии детекции различных биомаркеров для диагностических целей. Одной из наиболее перспективных является технология поверхностного плазмонного резонанса (SPR) [1]. Биосенсоры на эффекте SPR обладают рядом существенных преимуществ, такими как универсальность принципа анализа любых аналитов, линейный динамический диапазон анализа, более высокая точность и воспроизводимость по сравнению с ИФА (коэффициент вариации определения концентрации целевого белка в сыворотке крови < 1.5% в одной серии и < 3% в разных сериях) и высокая степень автоматизации. Однако существующая общая для всех методов регистрации проблема ограничения достоверного обнаружения низких концентраций биомаркера в сыворотке крови при прямой регистрации его взаимодействия со специфическим моноклональным антителом (> 1 нМ) актуальна и для SPR биосенсоров. В то же время содержание важных для биомедицины биомаркеров в плазме крови, как правило, на порядки ниже (0.1 – 100 пМ). Поэтому повышение чувствительности SPR биосенсоров для разработки новых методов диагностики на сегодня является одной из актуальных задач.

Известны различные подходы для усиления SPR сигнала: золотые наночастицы [2], «сандвич»–схема с двумя антителами [3-5], самоформирующиеся монослои и «сандвич»–схема [6,7], латексные частицы [8], сопряженная ферментативная реакция преципитации [9]. Применение наночастиц для усиления сигнала оптического SPR биосенсора представляется особенно перспективным подходом, так как величина сигнала биосенсора прямо пропорциональна массе аналита, взаимодействующего с иммобилизованным на поверхности оптического чипа лигандом. Поэтому утяжеление молекул аналита путем их селективной конъюгации с наночастицами может значительно (на порядки) усилить сигнал и, соответственно, понизить детектируемый порог концентраций биомаркера. Целью данной работы являлось описание протокола детекции белков в низкой концентрации на базе оптического SPR биосенсора с использованием золотых наночастиц.

MАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы и препараты белков

Следующие растворы и реагенты были получены от «GE Healthcare» (США): (1) HBS-EP+ буфер (150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0.005% детергента P20, 10 мМ HEPES, pH 7.4); (2) 10 мМ ацетатный буфер, pH 5.0; (3) 10 мМ глицин-НСl (pH 2.5); (4) набор реагентов для ковалентной иммобилизации лигандов за аминогруппы: EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид), NHS (N-гидроксисукцинимид), 1 М этаноламин-HCl (pH 8.5); (5) бета-2-микроглобулин человека (B2M); (6) поликолональные антитела кролика (Pab) к B2M; (7) моноклональные антитела мыши (Mab) к B2M. Бычий сывороточный альбумин (БСА) был получен от «Сalbiochem» (США).

Реактивы для синтеза золотых наночастиц были получены от «Sigma Aldrich» (США): (1) тетрахлораурат водорода (HAuCl₄•3H₂O); (2) цитрат натрия (C₃H₄OH(COONa)₃•2H₂O); (3) боргидрид натрия (NaBH₄).

Другие реактивы и препараты аналитической чистоты были получены от отечественных поставщиков.

Протокол синтеза золотых наночастиц (GNP) [10]

1. Приготовить 50 мл водного раствора, содержащего 0.1 мМ HAuCl₄•3H₂O и 0.15 мМ
   C₃H₄OH(COONa)₃•2H₂O (цитрат натрия).
2. Приготовить 0.5 мл раствора 0.05 М NaBH₄.
3. При постоянном перемешивании прилить по каплям 0.5 мл свежеприготовленного раствора 0.05 М NaBH₄.
4. Хранить полученную суспензию золотых наночастиц в темноте при температуре 4°С.

Протокол получения конъюгатов поликлональных антител (Pab) с золотыми наночастицами (Pab/GNP)

1. Приготовить 100 мкл раствора Pab (50 мкг/мл) в 5 мМ фосфатном буфере (pH 7.5).
2. Добавить к приготовленному раствору Pab 900 мкл суспензии золотых наночастиц.
3. Инкубировать в темноте при комнатной температуре 60 мин.
4. Добавить 100 мкл раствора БСА (10 %) в 50 мМ фосфатном буфере (pH 9.0).
5. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
6. Центрифугировать при скорости 16100 g и температуре 4°С в течение 60 мин.
7. Отобрать супернатант.
8. Оставшийся осадок ресуспензировать в 99 мкл HBS-ЕР+ буфера.
9. Для длительного хранения добавить 0.02% NaN₃ для подавления бактериального роста.
10. Хранить полученные конъюгаты Pab/GNP в темноте при температуре 4°С.

Определение концентрации золотых наночастиц, конъюгированных с Pab

Концентрация золотых наночастиц в суспензии была определена на спектрофотометре NanoDrop 1000 («Thermo Scientific», США) при длине волны 520 нм.

Ковалентная иммобилизация моноклональных антител мыши (Mab) к B2M на поверхности оптического чипа

Иммобилизация Mab и регистрация белок-белковых взаимодействий были выполнены на оптическом биосенсоре Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием чипа CM5, покрытого карбоксиметилированным декстраном. Mab иммобилизовали согласно стандартному протоколу иммобилизации за аминогруппы белка [11].

Протокол иммобилизации Mab

1. Приготовление смеси растворов 100 мМ NHS и 400 мМ EDC (1:1).
2. Инжекция приготовленной смеси растворов NHS/EDC в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин.
3. Приготовление раствора Mab в концентрации 50 мкг/мл в 10 мМ ацетатном буфере (рН 5.0).
4. Инжекция раствора Mab в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин.
5. Инжекция раствора 1 М этаноламина (рН 8.5) в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин.

В таблице 1 в качестве примера представлен пошаговый протокол работы оптического биосенсора Biacore 3000 при выполнении процедуры иммобилизации Mab. В данном протоколе отражены все начальные установки биосенсора и последующие их изменения, а также все выполняемые операции.

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 1. Пошаговый протокол работы оптического биосенсора при выполнении процедуры иммобилизации Mab к B2M.

На рисунке 1 представлена соответствующая сенсограмма иммобилизации Mab. Стрелками указаны моменты начала инжекций растворов в соответствии с протоколом. Инжекция смеси NHS/EDC активирует карбоксильные группы на поверхности чипа.

При инжекции раствора Mab происходит иммобилизация антител на поверхности чипа путем формирования амидных связей между аминогруппами белка и карбоксильными группами карбоксиметилированного декстрана. Не вступившие в реакцию активные группы на поверхности чипа инактивируются раствором этаноламина. В результате выполнения данного протокола количество иммобилизованного белка составило 10486 RU (резонансные единицы), а 1 RU соответствует связыванию примерно 1 пг белка на 1 мм² поверхности оптического чипа.

Регистрация белок-белковых взаимодействий

Пошаговый протокол всех выполненных операций и установок биосенсора для регистрации белок-белковых взаимодействий представлен в таблице 2.

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 2. Пошаговый протокол работы оптического биосенсора при выполнении регистрации белок-белковых взаимодействий.

Оптический биосенсор был термостатирован при 25°С, а в качестве рабочего буфера использовали HBS-ЕР+ буфер. Все инжекции растворов выполнялись в режиме QuickInject при скорости потока 10 мкл/мин. Взаимодействие B2M (100 пМ) с иммобилизованными на чипе Mab регистрировалось в течение 5 мин. Последующее усиление сигнала по «сандвич»-схеме при инжекции Pab или конъюгата Pab/GNP регистрировалось в течение 3 мин. Регенерация поверхности чипа выполнялась при инжекции 10 мМ глицин-HCl (рН 2.5) в течение 30 с при скорости потока 10 мкл/мин. Канал биосенсора без иммобилизованного белка использовался в качестве контрольного для коррекции эффектов неспецифической сорбции белкового материала на поверхности чипа путем вычитания сигнала контрольного канала из сигнала рабочего канала.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение концентрации золотых наночастиц в суспензии

Измерение оптической плотности суспензии GNP и конъюгатов Pab/GNP было выполнено на спектрофотометре NanoDrop 1000. На рисунке 2 показан спектр поглощения образца суспензии GNP в концентрации 20 мкг/мл, из которого следует, что присутствует характерный для коллоидного золота пик поглощения при длине волны 520 нм.

На основе значений оптической плотности при 520 нм для разных концентраций золотых наночастиц (от 1 до 20 мкг/мл) был построен калибровочный график (рис. 3). По данному калибровочному графику была определена концентрация суспензии конъюгатов Pab/GNP, которая составила 65 мкг/мл. Образец для спектрофотометрирования готовили путем разведения исходной суспензии в 5 раз.

Усиление сигнала биосенсора с помощью Pab и конъюгатов Pab/GNP

Усиление сигнала биосенсора по «сандвич»-схеме с помощью конъюгатов Pab/GNP осуществляли путем последовательных инжекций раствора B2M и суспензии конъюгатов Pab/GNP через канал биосенсора с иммобилизованными Mab. На рисунке 4 показаны две совмещенные сенсограммы связывания B2M (стрелка 1) с иммобилизованными на чипе Mab и усиление сигнала биосенсора по типу «сандвич» при инжекции растворов (стрелка 2) Pab (красная сенсограмма) или конъюгатов Pab/GNP (зеленая сенсограмма). Как видно из рисунка, возрастание сигнала после образования тройного комплекса Mab-B2M-Pab составило 55 RU, в то время как при образовании комплекса Mab-B2M-Pab/GNP сигнал вырос до 285 RU (примерно в 5 раз).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На примере бета-2-микроглобулина (В2М) в качестве модели биомаркера и двух типов антител (поликлональных и моноклональных) к нему описан высокочувствительный метод детекции низких концентраций В2М с помощью усиления сигнала SPR биосенсора с использованием золотых наночастиц. Данный принцип анализа носит универсальный характер и может быть успешно применен для детекции любых белковых биомаркеров. Стоит отметить, что для анализа биомаркеров в предельно низкой концентрации требуется значительное время для их связывания с первым антителом (до 1 ч и более), и поэтому более целесообразно использовать схему анализа по принципу «обратного сандвича», когда конъюгат Pab/GNP добавляется в образец сыворотки крови и инкубируется в течении 1 ч. За время инкубации в пробе происходит формирование комплекса биомаркер-Pab/GNP. Затем смесь инжектируется через канал биосенсора с иммобилизованным Mab, где и происходит быстрое формирование конечного «сандвича» Mab-биомаркер-Pab/GNP с регистрацией усиленного золотыми наночастицами SPR сигнала. Данный протокол подробно описан нами на примере анализа крайне низких концентраций кардиомиоглобина в сыворотке крови человека [5].

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 годы. SPR измерения выполнены на оборудовании ЦКП «Протеом человека» при ИБМХ, поддержанном Минобрнауки РФ в рамках соглашения №14.621.21.0017 (идентификатор RFMEFI62117X0017).

ЛИТЕРАТУРА

1. Homola, J., Vaisocherová, H., Dostálek, J. & Piliarik M. (2005) Multi-analyte surface plasmon resonance biosensing. Methods, 37(1), 26-36. DOI
2. Hong, B. & Kang, K.A. (2006) Biocompatible, nanogold-particle fluorescence enhancer for fluorophore mediated, optical immunosensor. Biosensors and Bioelectronics, 21(7), 1333-1338. DOI
3. Liu, X., Sun, Y., Song, D., Zhang, Q., Tian, Y., Bi, S., & Zhang, H. (2004) Sensitivity-enhancement of wavelength-modulation surface plasmon resonance biosensor for human complement factor 4. Analytical Biochemistry, 333(1), 99-104. DOI
4. Wei, J., Mu, Y., Song, D., Fang, X,, Liu, X,, Bu, L,, Zhang, H., Zhang, G,, Ding, J., Wan,g W., Jin, Q. & Luo, G. (2003) A novel sandwich immunosensing method for measuring cardiac troponin I in sera. Analytical Biochemistry, 321, 209–216. DOI
5. Gnedenko, O.V., Mezentsev, Y.V., Molnar, A.A., Lisitsa, A.V., Ivanov, A.S. & Archakov, A.I. (2013) Highly sensitive detection of human cardiac myoglobin using a reverse sandwich immunoassay with a gold nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta, 759, 105-9. DOI
6. Dutra, R.F. & Kubota, L.T. (2007) An SPR immunosensor for human cardiac troponin T using specific binding avidin to biotin at carboxymethyldextran-modified goldchip. Clinica Chimica Acta, 376, 114–120. DOI
7. Teramura, Y. & Iwata, H. (2007) Label-free immunosensing for alpha-fetoprotein in human plasma using surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry, 365(2), 201–207. DOI
8. Besselink, G.A., Kooyman, R.P., van Os, P.J., Engbers, G.H. & Schasfoort, R.B. (2004) Signal amplification on planar and gel-type sensor surfaces in surface plasmon resonance-based detection of prostate-specific antigen. Analytical Biochemistry, 333(10), 165–173. DOI
9. Kim, M.G., Shin, Y.B. & Jung, J.M. (2005) Enhanced sensitivity of surface plasmon resonance (SPR) immunoassays using a peroxidase-catalyzed precipitation reaction and its application to a protein microarray. Journal of Immunological Methods, 297(1-2), 125-132. DOI
10. Wang, M., Wang, L., Wang, G., Ji, X., Bai, Y., Li, T., Gong, S. & Li, J. (2004) Application of impedance spectroscopy for monitoring colloid Au-enhanced antibody immobilization and antibody–antigen reactions. Biosensensors and Bioelectronics, 19(6), 575-582. DOI
11. Biacore Sensor Surface Handbook GE Healthcare BR-1005-71 Edition AB 05/2008. P. 39-41.