Использование метода количественной ПЦР для диагностики
бактериального вагиноза

Сенина М.Е.^1*, Савочкина Ю.А.¹, Скворцов Л.В.¹, Попова Т.И.², Джеджеиа Л.В.²

¹ООО НПФ «Литех», 107023 г.Москва, ул. Малая Семеновская, 3А, стр. 2;
^*e-mail: senina_maria@mail.ru
²ООО «Лаборатория Литех», 107023 г.Москва, ул. Малая Семеновская 3А, стр. 2

Ключевые слова: ПЦР в реальном времени; Eggerthella; Bacterial Vaginosis–Associated Bacteria 2; Megasphaera
type 1; Фемоскрин

DOI: 10.18097/BMCRM00084

ВВЕДЕНИЕ

Микроэкосистема влагалища обладает высокой восприимчивостью к местным воздействиям и подвержена влиянию половых гормонов. Её состав зависит от фазы менструального цикла, беременности, менопаузы, сексуальной активности, гигиенических привычек, приёма антибиотиков и других факторов. При использовании противозачаточных средств, смене половых партнёров, применении антибиотиков широкого спектра действия, количество лактобацилл в микрофлоре влагалища может уменьшаться, а доля таких микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis и анаэробов – возрастать, что приводит к формированию дисбактериоза влагалища – бактериального вагиноза (БВ).

Получение корректного представления о составе влагалищной микрофлоры важно в плане предотвращения возникновения как инфекций мочевыводящей системы у женщин, так и инфекций, передающихся половым путём. Любой дисбаланс облигатной и факультативной микрофлоры влагалища вызывает дисбактериоз, который является фактором риска при возникновении инфекции [1]. БВ - наиболее распространённое вагинальное расстройство у женщин репродуктивного возраста [2], которое чаще всего проявляется нехарактерными выделениями из влагалища и может вызывать негативные для организма женщины последствия, такие как преждевременные роды [3], инфекции околоплодных вод [4], хориоамнионит [5], воспалительные заболевания органов малого таза [6-9], цервицит [10, 11] и повышение восприимчивости организма женщины к различным инфекциям - Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, HSV-2 [12-14] и HIV [15].

Предполагается, что причиной БВ является не единичный возбудитель, а скорее нарушение общего баланса влагалищной микрофлоры, проявляющееся как уменьшение доли нормальной микрофлоры (Lactobacillus spp.) и интенсивное увеличение титра условно-патогенных аэробных и анаэробных бактерий [16]. Методами классической микробиологии выявляются следующие бактериальные виды – Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Porphyromonas spp., Bacteroides spp., Peptostreptococcus spp., Mobiluncus spp. и Mycoplasma hominis [17].

С развитием различных молекулярно-генетических подходов стало очевидно, что степень разнообразия микробных биотопов была сильно недооценена. Так, в микрофлоре влагалища были обнаружены неизвестные ранее бактерии - Atopobium vaginae, Eggerthella, Megasphaera spp., Leptotrichia spp., Dialister spp. и три вида - BVAB1, BVAB2, BVAB3, принадлежавшие к порядку Clostridiales [18-22]. С учетом того, что БВ может негативно сказываться на здоровье женщин репродуктивного возраста, существует необходимость использования быстрых и точных методов диагностики. Именно поэтому так активно развиваются молекулярно-биологические методы диагностики для изучения разнообразия бактериальной флоры, основанные на количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [23-25], пиросеквенировании [17] и др. Мы применили набор «Фемоскрин» (см. описание в разделе «Материалы и методы») производства НПФ «Литех» (Россия), разработанный на основе ПЦР в реальном времени, для комплексной диагностики БВ, и сравнили полученные результаты с данными традиционного цитологического исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 146 мазков слизистой влагалища, поступивших на комплексное микроскопическое исследование в «Лаборатория Литех». Мазки были собраны от женщин репродуктивного возраста – посетителей «Лаборатория Литех». Средний возраст обследуемых составил 29.8 ± 7.5 лет.

Состояние влагалищной микрофлоры оценивали по критериям Ньюджента. Для этого мазок слизистой окрашивали по Граму и подсчитывали количество выявленных морфотипов бактерий под иммерсионным микроскопом (Табл. 1)

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 1. Система баллов Ньюджента (от 0 до 10) для диагностики бактериального вагиноза с помощью микроскопии.

Экстракцию ДНК для ПЦР-анализа проводили с помощью реагента "ДНК-ЭКСПРЕСС" (НПФ «Литех») в соответствии с инструкцией производителя.

Выделенные образцы ДНК анализировали с использованием набора реагентов «Фемоскрин» в соответствии с инструкцией производителя. Набор реагентов «Фемоскрин» предназначен для выявления и количественного определения бактерий, ассоциированных с БВ, методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. В результате анализа для каждого образца дается три типа заключения: «нормоценоз», «нарушение микрофлоры влагалища», «бактериальный вагиноз». Общая схема работы с набором представлена на рисунке 1.

ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Рисунок 1. Схема анализа образца с помощью набора реагентов «Фемоскрин».

При анализе с помощью набора реагентов «Фемоскрин» один образец ДНК вносят в четыре пробирки, в которых проходит дифференцированное определение следующих микроорганизмов (показателей):

Пробирка 1 – Общая бактериальная масса;

Пробирка 2 – Lactobacillus spp. + Gardnerella vaginalis + Atopobium vaginae + контроль взятия материала (ДНК человека);

Пробирка 3 – Mobiluncus curtisii + Prevotella spp. + Candida albicans + контроль взятия материала (ДНК человека);

Пробирка 4 – Eggerthella + Bacterial Vaginosis–Associated Bacteria 2 + Megasphaera type 1 + контроль взятия материала (ДНК человека).

При проведении регистрации продуктов амплификации в процессе реакции («в реальном времени») измерения проводятся в каждом цикле амплификации. С использованием специально подобранных настроек анализирующая программа автоматически рассчитывает циклы пересечения кривых накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией (Ct). Значение Ct обратно пропорционально концентрации ДНК в образце. Для количественной оценки значение Ct (цикл пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией) исследуемого образца сравнивается со значением Ct ПКО (положительного контрольного образца) с известной концентрацией ДНК (Рис. 2). Концентрация ДНК в исследуемом образце вычисляется по формуле:

$${{\rm C}}_{{\rm Образца}}{\rm =\ }{{\rm C}}_{{\rm ПКО}}\times {\rm \ }{{\rm 2}}^{{\rm (}{{\rm Ct}}_{{\rm пко}}{\rm -}{{\rm Ct}}_{{\rm Образца}}{\rm )}}$$

(1),

где С_{Образца} – концентрация ДНК возбудителя (или человека) в исследуемом образце, выраженная в геном-эквивалентах/мл (ГЭ/мл), С_ПКО – концентрация плазмиды, несущей специфический фрагмент ДНК соответствующего возбудителя (или человека), в ПКО, выраженная в геном-эквивалентах/мл (представлена во вкладыше к набору), Ct_{Образца} – цикл пересечения кривой флуоресценции исследуемого образца с пороговой линией; Ct_ПКО – цикл пересечения кривой флуоресценции положительного контрольного образца с пороговой линией.

ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Рисунок 2. Кривые амплификации и определение значения Ct.

Образцы, содержащие недостаточное количество ДНК человека (менее 5 × 10³ ГЭ/мл), а также общей бактериальной массы (менее 5 × 10⁵ ГЭ/мл), исключаются из анализа как невалидные. Для остальных образцов производится расчет индекса БВ:

$${\rm Индекс}{\rm \ }{\rm БВ}{\rm \ =\ Lg}\left({\rm Lac}\right){\rm \ }-{\rm \ Lg}\left({\rm Gard+Atop}\right){\rm -}{\rm \ }$$ $${\rm 0.5\ x\ Lg(Prev+Mob+Egg+BVAB2+Mega)}$$

(2).

Сокращения обозначают рассчитанную концентрацию ДНК соответствующего микроорганизма в исследуемом образце (в ГЭ/мл): Lac – Lactobacillus spp, Gard - Gardnerella vaginalis, Atop - Atopobium vaginae, Prev - Prevotella spp., Mob - Mobiluncus curtisi; Egg – Eggerthella, BVAB2 - Bacterial Vaginosis–Associated Bacteria 2; Mega - Megasphaera type 1.

Если индекс БВ больше 1, то образец относится к группе «Нормоценоз», если меньше 1, но больше -2, то в группу «нарушения микрофлоры влагалища»; если индекс БВ менее -2, то образец относится к группе «Бактериальный вагиноз».

Возможна автоматическая интерпретация результатов анализа с помощью вспомогательной программы. Примеры представлены на рисунке 3.

ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Рисунок 3. Примеры интерпретации результатов для образцов, отнесенных к группе «нормоценоз» (А), «нарушение микрофлоры влагалища» (В) и «бактериальный вагиноз» (С).

Цветные столбцы отражают графическое представление десятичного логарифма концентрации ДНК соответствующего микроорганизма на 100000 клеток человека. Желтый цвет столбцов относится к показателю «Общая бактериальная масса», зеленый – к показателям «ДНК человека» и Lactobacillus spp. Красный цвет столбцов для условно патогенных возбудителей означает превышение содержания ДНК возбудителя над установленным производителем набора реагентов пороговым уровнем, серый – содержание ДНК возбудителя не превышает порогового уровня.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На основании данных цитологического исследования была сформирована выборка, содержащая 146 образцов, в которую вошли образцы от пациенток с диагнозом «бактериальный вагиноз» (10/146, 6.8%), с нарушением микрофлоры влагалища (промежуточная микрофлора, 73/146, 50.0%) и с нормоценозом (63/146, 43.2%). По результатам тестирования образцов с использованием набора реагентов «Фемоскрин» 81 образец был отнесен к категории «нормоценоз», 53 – к категории «нарушение микрофлоры влагалища» и 12 – к категории «бактериальный вагиноз».

В группе пациенток с нормоценозом (n = 63), по результатам тестирования набором «Фемоскрин», к категории «нормоценоз» было отнесено 59 образцов (59/63, 93.7%). В группе пациенток с нарушением микрофлоры влагалища (n = 73), по данным набора «Фемоскрин», к категории «нарушение микрофлоры влагалища» было отнесено 48 образцов (48/73; 65.8 %).

В группе пациенток с бактериальным вагинозом (n = 10), установленным по данным цитологического исследования, диагноз был подтвержден для 9 пациенток (9/10, 90.0%)

ОБСУЖДЕНИЕ

Методы молекулярной диагностики, основанные на ПЦР, становятся все более распространенными благодаря ряду преимуществ, среди которых все большее значение приобретают простота работы, возможность автоматизации и меньший субъективизм при интерпретации результата. Активно разрабатываются наборы реагентов на основе количественной ПЦР в «реальном времени» для изучения разнообразия бактериальной флоры [23-25]. Мы применили набор «Фемоскрин» для комплексной диагностики бактериального вагиноза, и сравнили полученные результаты с данными традиционного цитологического исследования.

В группе образцов с установленным диагнозом «бактериальный вагиноз» существенных расхождений между результатами генетического и цитологического исследования обнаружено не было. Наблюдаемые небольшие расхождения в группах «нормоценоз» и «нарушение микрофлоры влагалища», вероятно, связаны с тем, что начальные патологические изменения (пограничные состояния) не всегда могут быть однозначно интерпретированы в сторону одного или другого состояния. Подобные результаты, когда не может быть выявлена чёткая разница между нормоценозом и начинающимся нарушением микрофлоры влагалища – достаточно распространённое явление, которое описано в других подобных исследованиях [26].

Сопоставление данных, полученных с помощью набора «Фемоскрин», с результатами цитологического исследования позволили оценить диагностическую чувствительность и специфичность по отношению к диагнозу «бактериальный вагиноз». Диагностическая чувствительность набора рассчитывалась как отношение числа истинно положительных результатов нового теста к сумме истинно положительных и ложноотрицательных образцов нового теста:

$${\rm Диагностическая\ чувствительность\ =\ ИП/(ИП+ЛО)\ х\ 100\%}{\rm \ }$$

(3),

где ИП – число истинно положительных образцов, а ЛО – ложно отрицательных образцов, полученных с использованием нового теста.

Диагностическая чувствительность набора реагентов «Фемоскрин» составила 90.0% (55.5 – 99.8%) для БВ.

Диагностическая специфичность рассчитывалась как отношение истинно отрицательных результатов нового теста к сумме истинно отрицательных и ложноположительных результатов нового теста:

$${\rm Диагностическая\ специфичность\ =\ ИО/(ИО+ЛП)\ х\ 100\%}{\rm \ }$$

(4),

где ИО – число истинно отрицательных образцов, а ЛП – ложно положительных образцов, полученных с использованием нового теста.

Диагностическая специфичность набора реагентов «Фемоскрин» составила 97.8 % (93.7- 99.5%) для БВ.

Доверительные интервалы были посчитаны с помощью онлайн сервиса https://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php. Данные суммированы в таблице 2.

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 2. Полученные значения диагностической чувствительности и специфичности набора реагентов «Фемоскрин».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

По результатам проведенного анализа можно сделать вывод о том, что набор реагентов «Фемоскрин» может служить дополнительным инструментом тестирования при микроскопическом (цитологическом) исследовании влагалищной микрофлоры, т.к. он показал высокую эффективность и минимальное количество невалидных результатов. Результаты, полученные с помощью набора реагентов «Фемоскрин», хорошо коррелирует с данными цитологии. Набор сочетает в себе функционал близких аналогов - с одной стороны, позволяет проанализировать состав микробиоты урогенитального тракта аналогично серии наборов реагентов «Фемофлор» (НПФ «ДНК-технологии», Россия), с другой стороны, позволяет диагностировать бактериальный вагиноз аналогично набору реагентов «Флороценоз-БВ» ( «Интерлабсервис», Россия).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие на использование их биоматериала.

ЛИТЕРАТУРА

1. Martin, D.H., Zozaya, M., Lillis, R., Miller, J., Ferris. The microbiota of the human genitourinary tract: trying to see the forest through the trees. MJ.Trans Am Clin Climatol Assoc. 2012; 123:242-56.
2. Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis:a public health review. Br J Obstet Gynaecol. 2001;108: 439–450. DOI
3. Hillier, S.L., Nugent, R.P., Eschenbach, D.A., Krohn, M.A., Gibbs, R.S., et al. Association between bacterial vaginosis and preterm delivery of a low-birth-weight infant. The Vaginal Infections and Prematurity Study Group. N Engl J Med. 1995; 333: 1737–1742. DOI
4. Silver, H.M., Sperling, R.S., St Clair, P.J., Gibbs, R.S. Evidence relating bacterial vaginosis to intraamniotic infection. Am J Obstet Gynecol. N Engl J Med. 1989; 161: 808–812. DOI
5. Hillier, S.L., Martius, J., Krohn., M, Kiviat, N., Holmes, K.K., et al A case-control study of chorioamnionic infection and histologic chorioamnionitis in prematurity. N Engl J Med.1988; 319: 972–978. DOI
6. Sweet, R.L. Role of bacterial vaginosis in pelvic inflammatory disease. Clin Infect Dis. 1995; 20: S271–S275. DOI
7. Hillier, S.L., Kiviat, N.B., Hawes, S.E., Hasselquist, M.B., Hanssen, P.W., et al. Role of bacterial vaginosis-associated microorganisms in endometritis. Am J Obstet Gynecol.1996;175: 435–441. DOI
8. Wiesenfeld H, Hillier S, Krohn M, Amortegui AJ, Heine RP, et al. Lower genital tract infection and endometritis: insight into subclinical pelvic inflammatory disease. Obstet Gynecol. 2002; 100: 456–463. DOI
9. Haggerty, C.L., Hillier, S.L., Bass, D.C., Ness, R.B. Bacterial vaginosis and anaerobic bacteria are associated with endometritis. Clin Infect Dis. 2004; 39: 990–995. DOI
10. Schwebke, J.R., Schulien, M.B., Zajackowski, M. Pilot study to evaluate the appropriate management of patients with coexistent bacterial vaginosis and cervicitis. Infect Dis Obstet Gynecol.1995; 3: 119–122. DOI
11. Schwebke, J.R., Weiss, H.L. Interrelationships of bacterial vaginosis and cervical inflammation. Sex Transm Dis. 2002; 29: 59–64 . DOI
12. Wiesenfeld, H.C., Hillier, S.L., Krohn, M.A., Landers, D.V., Sweet, R.L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clin Infect Dis. 2003; 36: 663–668. DOI
13. Allsworth, J.E., Peipert, J.F. Severity of bacterial vaginosis and the risk of sexually transmitted infection. Am J Obstet Gynecol. 2011; 205: 113.e1-113.e6. DOI
14. Cherpes, T.L., Meyn, L.A., Krohn, M.A., Lurie, J.G., Hillier, S.L. Association between acquisition of herpes simplex virus type 2 in women and bacterial vaginosis. Clin Infect Dis. 2003; 37: 319–325. DOI
15. Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z.A., Wright, T.C. Jr., Denny,L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet Infect Dis. 2005; 5:786–794. DOI
16. Eschenbach, D.A. Bacterial vaginosis and anaerobes in obstetric-gynecologic infection. Clin Infect Dis. 1993; 16: S282–S287.
17. Spiegel, C.A. Bacterial vaginosis. Rev Med Microbiol. 2002;13: 43–51. DOI
18. Wang, K.D., Su, JR. Quantification of Atopobium vaginae loads may be a new method for the diagnosis of bacterial vaginosis. Clin Lab. 2014;60(9):1501-8. DOI
19. Shipitsyna, E.,Roos, A., Datcu, R., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age - sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible? PLoS One. 2013; 8: e60670. DOI
20. Verhelst, R., Verstraelen, H., Claeys, G., Verschraegen, G., Delanghe, J., et al. Cloning of 16S rRNA genes amplified from normal and disturbed vaginal microflora suggests a strong association between Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis and bacterial vaginosis. BMC Microbiol. 2004; 4: 16. DOI
21. Fredricks, D.N., Fiedler, T.L., Marrazzo, J.M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N Engl J Med. 2005; 353:1899 1911. DOI
22. Verstraelen, H., Verhelst, R., Claeys, G., Temmerman M, Vaneechoutte M. Culture-independent analysis of vaginal microflora: the unrecognized association of Atopobium vaginae with bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol. 2004; 191: 1130–1132. DOI
23. Zozaya-Hinchliffe, M., Martin, D.H., Ferris, M.J. Prevalence and abundance of uncultivated Megasphaera-like bacteria in the human vaginal environment. Appl Environ Microbiol. 2008; 74: 1656–1659. DOI
24. Zariffard, M.R., Saifuddin, M., Sha, B.E., Spear, G.T. Detection of bacterial vaginosis-related organisms by real-time PCR for Lactobacilli, Gardnerella vaginalis and Mycoplasma hominis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002; 34: 277–281. DOI
25. Sha, B.E., Chen, H.Y., Wang, Q.J., Zariffard, M.R., Cohen, M.H., et al. Utility of Amsel criteria, Nugent score, and quantitative PCR for Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, and Lactobacillus spp for diagnosis of bacterial vaginosis in human immunodeficiency virus-infected women. J Clin Microbiol. 2005; 43: 4607–4612. DOI
26. Cartwright, C.P., Lembke, B.D., Ramachandran, K., Body, B.A., Nye, M.B., et al. Development and validation of a semi-quantitative, multi-target, PCR assay for the diagnosis of bacterial vaginosis. J Clin Microbiol. 2012; 50: 2321–2329. DOI