Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

П.В. Ершов¹*, Ю.В. Мезенцев¹, Е.О. Яблоков¹, Л.А. Калужский¹, И.В. Вахрушев¹, О.В. Гнеденко¹, А.В. Флоринская¹, А.А. Гилеп², С.А. Усанов², К.Н. Ярыгин¹, А.С. Иванов¹.

¹Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича,
119121, Москва, Погодинская ул. 10; ^*e-mail: pavel79@inbox.ru
²Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси,
220141, Минск, ул. Академика В.Ф. Купревича 5, корп.2

Ключевые слова: поверхностный плазмонный резонанс; лизат HepG2; пробоподготовка лизата; закисление-нейтрализация; белковые комплексы

DOI: 10.18097/BMCRM00090

ВВЕДЕНИЕ

В живом организме наиболее распространенным типом макромолекул являются одиночные белковые молекулы, а также их стабильные белковые комплексы, участвующие в многочисленных биологических процессах. Протеомная идентификация и количественная характеризация белок-белковых взаимодействий являются фактически одним из главных движущих факторов в формировании целостных представлений о молекулярном узнавании. SPR (Surface Plasmon Resonance) биосенсоры получили широкое распространение в протеомных исследованиях не только в качестве независимого инструмента для прямого подтверждения белок-белковых взаимодействий, но и в различных сочетаниях с другими технологиями, такими как гель-фильтрация, аффинная хроматография, парамагнитные наночастицы и масс-спектрометрия [1-4]. Исследование субинтерактома отдельного целевого белка (белка-наживки) часто выполняют путем аффинного выделения белков-партнеров из тканевых и клеточных лизатов и последующей масс-спектрометрической идентификацией (LC/MS-MS). В такой схеме SPR анализ востребован как на финальном этапе, когда валидируют взаимодействия идентифицированных потенциальных белков-партнеров с белком-наживкой, так и перед аффинным выделением для предварительной оценки лизатов на наличие белков-партнеров, моделирования и оптимизации многих процедур аффинного выделения [5]. Фактически, эксперименты по молекулярной “рыбалке” или фишингу (от англ. molecular fishing) выполняются следующим образом. Белок-наживку ковалентно иммобилизуют на инертном сорбенте (например, BrCN-сефароза 4В) или носителе (парамагнитные наночастицы). Затем интактный тканевой (клеточный) лизат инкубируют с аффинным носителем или пропускают через хроматографическую колонку с аффинным сорбентом. Белки-партнеры из лизата, аффинно связавшиеся с белком-наживкой, элюируют, а белковый состав элюатов идентифицируют с помощью LC/MS-MS [1-4]. Тем не менее, несмотря на простоту и предсказуемость данного метода, имеются, по крайней мере, две проблемы, такие как избыточность масс-спектрометрической идентификации фоновых белков в элюатах и низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы. Так, появление первого обусловлено выделением мультибелковых комплексов, «меченых» прямым белком-партнером, который связывается с белком-наживкой на сорбенте, что, в конечном итоге, ожидаемо приводит к снижению специфичности молекулярного фишинга вследствие контаминации элюатов фоновыми белками. Второе, напротив, вызвано тем, что в интактном лизате та или иная часть прямых белков-партнеров находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой (присутствующем в лизате), а следовательно, данная группа белков-партнеров не будет в достаточной степени выделена из лизата, что отражается на снижении эффективности молекулярного фишинга. Поэтому становится очевидным, что выбор тактики пробоподготовки лизатов для аффинного выделения белков-партнеров влияет на количество и качественный состав идентифицированных LC/MS-MS белков. В настоящей работе на примере лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека HepG2 (клетки HepG2) и ряда рекомбинантных белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, продемонстрированы модельные эксперименты под контролем SPR биосенсора, которые легли в основу модификации традиционного подхода к пробоподготовке лизатов для аффинного выделения из них белков-партнеров для целевого белка. Данный подход заключается в предварительной диссоциации стабильных белковых комплексов интактного лизата путем его кратковременного закисления и последующей нейтрализации.

MАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические реактивы

Химические реактивы были получены от «GE Healthcare» (США): 10Х HBS-N буфер (100 мМ HEPES, 1500 мМ NaCl, pH 7.4); 10Х HBS-EP+ буфер (100 мМ HEPES, 1500 мМ NaCl, 30 мМ ЭДТА, 0.5% детергента P20, pH 7.4); EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид), NHS (N-гидроксисукцинимид), 1 М этаноламин-HCl (pH 8.5), 10 мМ глицин-HCl (рН 2.0). CHAPS был получен от «Sigma» (США). Раствор 100 мМ НСl был приготовлен из фиксанала («Реахим», Россия). Другие химические реактивы были аналитической чистоты и закупались от локальных компаний.

Белковые препараты

Препараты рекомбинантных белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека с чистотой > 95%, по гель-электрофорезу  в денатурирующих  условиях  были получены в  ИБОХ  НАН  Беларуси [6–8]: NADPН-зависимая адренодоксин редуктаза (ADR); декапентаплегический гомолог 4 (SMAD4); микросомальный цитохром b₅ (CYB5A); феррохелатаза (FECH); фактор транскрипции с доменом «цинковые пальцы» (CXXC1); мРНК-кэп-гуанин-N7-метилтрансфераза (RNMT). Белковые препараты транстиретина (TTR) и бычьего панкреатического трипсина (BPT) были получены от фирмы «Sigma». Белковый ингибитор VG (InhVG) (длиной 57 аминокислотных остатков) был получен от ТИБОХ ДВО РАН.

Биоматериалы

Культивирование клеток HepG2 проводили согласно описанному [9]. Лизат из клеток культуры HepG2 получали путем гомогенизации клеточной массы (примерно 200 млн. клеток) в ручном гомогенизаторе Sample griding kit («GE Healthcare»), содержащем специальный абразивный материал, с 1 мл лизирующего буфера CellLytic Mammalian Tissue Lysis/Extraction Reagent (Sigma, США) и 10 мкл коктейля ингибиторов протеаз («Sigma»). Содержание общего белка в образцах лизата клеток HepG2 определяли по методу Брэдфорд.

Протокол пробоподготовки лизата клеток HepG2

К образцу, содержащему 90 мкл 2Х HBS-N буфера, добавляли 10 мкл лизата клеток HepG2 (3 мг/мл общего белка) и 100 мкл 100 мМ HСl для резкого сдвига рН с 7.4 до 2.0 (финальная концентрация HСl составляла 50 мМ). Смесь инкубировали на льду в течение 1 мин. Затем сразу добавили 30 мкл титрованного раствора NaOH для нейтрализации кислоты и сдвига рН с 2.0 до 7.4, а затем еще 170 мкл 2Х буфера HBS-EP+, содержащего коктейль ингибиторов протеаз, до финального объема 400 мкл. В качестве контроля использовали образец лизата клеток HepG2 без добавления HСl, то есть 10 мкл лизата (3 мг/мл) и 190 мкл 1Х HBS-N буфера инкубировали на льду в течение 1 мин, а затем доводили 200 мкл 2Х HBS-EP+ буфера до финального объема 400 мкл. Далее контрольный и опытные образцы инжектировали по чипу с иммобилизованным белком CYB5A в течение 10 мин при скорости потока 5 мкл/мин.

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)

Ковалентная иммобилизация белков на оптическом чипе СМ5.

Все SPR измерения выполняли при 25°C в 4-х канальном оптическом биосенсоре Biacore 3000 («GE Healthcare»). Белки, кодируемые генами 18-ой хромосомы человека иммобилизовали за аминогруппы по стандартному протоколу. Сначала поверхность оптического чипа в рабочем канале биосенсора, покрытую карбоксиметилдекстраном, активировали путем инжекции смеси NHS/EDC в течение 7 мин при скорости потока 5 мкл/мин. Далее раствор белка (25 мкг/мл) инжектировали в течение 10 мин при скорости потока 10 мкл/мин. Первый канал (без иммобилизации белков) использовали в качестве контрольного канала для коррекции эффектов неспецифического связывания белкового материала к поверхности чипа. Таким образом, используя один четерехканальный чип CM5, можно иммобилизовать 3 разных белка.

Регистрация белок-белковых взаимодействий на оптическом биосенсоре.

В качестве рабочего буфера использовали 1Х HBS-EP+ буфер. Белки-аналиты, разведенные 1Х HBS-EP+ буфером до концентраций в диапазоне (1 – 10 мкМ), инжектировали в течение 5 или 10 мин при скорости потока 10 мкл/мин при 25°C. Регенерацию поверхности оптического чипа после каждой инжекции выполняли разными растворами с целью достижения максимальной степени очистки для выхода базовой линии сигнала биосенсора на уровень начала цикла. В качестве регенерационных растворов использовали 2M MgCl₂, 1% CHAPS, 10 мМ глицин-HCl (рН 2.0). Разведенные в 10 раз рабочим буфером образцы лизата клеток HepG2 инжектировали по чипу с иммобилизованными белками СYB5A, RNMT, CXXC1, TTR в течение 5 мин при скорости потока 5 мкл/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

SPR эксперименты для оценки эффективности химических реактивов вызывающих диссоциацию белковых комплексов

Образцы лизата клеток HepG2 инжектировали по каналам биосенсора с ковалентно иммобилизованными белками СYB5A, RNMT, CXXC1, TTR (рис. 1). Прочно связанный материал лизата с белками на чипе отмывали разными химическими реактивами: 2M MgCl₂, 1% CHAPS, 10 мМ глицин HCl (pH 2.0). На рисунке 1 это схематично показано в виде ступенчатого падения сигнала биосенсора.

В целом, можно отметить слабую регенерационную эффективность при однократных инжекциях растворов 2M MgCl₂ и 1% CHAPS, так эти реактивы по совокупности отмывали не более 50% связавшегося белкового материала. Напротив, использование 10 мМ глицин-HCl (рН 2.0) приводила к фактически полному удалению связавшегося белкового материала. В дополнительных SPR экспериментах нами было показано, что для некоторых гомоолигомерных белков [10-12], иммобилизованных на оптическом чипе при слабо кислых или нейтральных значениях рН, обработка 10 мМ глицин-HCl (рН 2.0) вызывала кратное падение сигнала биосенсора, что было обусловлено диссоциацией до мономеров (рис. 2А). Таким образом, фактор низких значений рН вносил решающий вклад в эффективную диссоциацию белковых комплексов.

SPR оценка кислотного «шока» на стабильность и связывающую

Модельные эксперименты проводили на следующих белковых парах: FECH/ADR, FECH/SMAD4, FECH/CYB5A. В работе [13] было показано, что данные белки способны образовывать гетеродимерные комплексы с K_d порядка 1 – 15 мкМ. Белок FECH был иммобилизован за аминогруппы на поверхности оптического чипа СМ5 по стандартному протоколу. Образцы белков-аналитов ADR, SMAD4 и CYB5A, предварительно обработанные 50 мМ HCl с последующей нейтрализацией, в конечной концентрации 5 мкМ (объемом 400 мкл) инжектировали в канал биосенсора с иммобилизованной FECH. В качестве контроля инжектировали образцы вышеуказанных белков без предварительной обработки 50 мМ HCl. Уровни связывания белков ADR, SMAD4 и CYB5A с феррохелатазой показаны на рисунке 2В. Можно отметить, что не все белки после кислотной обработки сохраняли исходную связывающую способность. Так, для цитохрома b₅ (CYB5A) отмечалось падение связывания с FECH по сравнению с контролем (рис. 2В), что могло быть следствием частичной денатурации или потери гема.

Мы выполняли также вспомогательные анализы образцов двух белков-аналитов (ADR и SMAD4) как до, так и после кислотной обработки и нейтрализации. Они были охарактеризованы по размеру частиц с использованием дзета сайзера МикроV (ZetaSizer microV, Malvern) с целью избежать артефактов в SPR измерениях белкового комплексообразования, которые могут сопровождаться агрегацией белковых молекул. Исходные растворы тестовых белков,  разведенные 1X HBS-EP+ до конечной концентрации общего белка около 0.5 мкг/мл, помещали в кварцевую кювету, рекомендуемую фирмой-производителем измерительного оборудования, объемом 45 мкл и анализировали в среднем по 15 циклов, каждый из которых проходил в течение 10 с. Пример анализа белкового препарата ADR показан на рисунке 3. Установлено, что белковые препараты ADR и SMAD4 были представлены в растворе в виде мономеров, и после кислотной обработки этих белковых препаратов не наблюдалось появления пиков интенсивности высокомолекулярных агрегатов.

SPR оценка эффективности диссоциации белковых комплексов «дикого типа» в лизате при кислотной обработке и нейтрализации

В работе [14] кислотный «шок» применяли для диссоциации комплексов белок-пептид «дикого типа». Образцы с белковым материалом титровали 0.1 M лимонной кислотой с pH 2.5 и затем инкубировали 2 мин на льду с последующей нейтрализацией кислоты, а высвобождаемые пептиды захватывали на хроматографической колонке. В нашей работе необходимо было диссоциировать стабильные белок-белковые комплексы лизата путем кислотной обработки так, чтобы, с одной стороны, это сопровождалось максимальной эффективностью диссоциации, а с другой стороны, оказывало минимальный денатурирующий эффект на чувствительные белки. Поэтому нами были использованы многократно разбавленные рабочим буфером исходные препараты лизата, короткое время экспозиции белков/белковых комплексов лизата с химическим фактором (фактор низкого рН) и резкие сдвиги рН. Так, сравнительный SPR анализ образцов лизата после обработки 50 мМ HCl показал, что сигналы связывания белкового материала с иммобилизованным на чипе цитохромом b₅ (CYB5A) значительно отличались от контроля (рис. 4, сенсограмма 1) и имел место двукратный прирост сигнала (рис. 4, сенсограмма 3), что обусловлено взаимодействием тех белков-партнеров лизата, которые находились в составе белковых комплексов высшего порядка, а значит, были недоступны для взаимодействия. Далее мы показали, что присутствие избытка экзогенного CYB5A (из расчета 2 мкг CYB5A на 1 мкг общего белка лизата) в образце лизата, подвергнутого кислотной обработке, на 80% гасило прирост сигнала биосенсора (рис. 4, сенсограмма 2), что можно объяснить «обратным титрованием» высвобожденных из комплексов «дикого типа» белков-партнеров экзогенным цитохромом b₅. При этом надо отметить, что в контрольных SPR экспериментах не было обнаружена олигомеризация СYB5A с самим собой, а значит, полученные результаты не являются артефактом олигомеризации.

Таким образом, предлагаемая модификация пробоподготовки клеточных/тканевых лизатов с применением кислотной обработки и последующей нейтрализации должны повысить эффективность и специфичность аффинного выделения прямых партнеров (для целевых белков-наживок), высвобождаемых из комплексов «дикого типа», а также снизить контаминацию элюатов с аффинного сорбента фоновыми белками при выполнении процедуры молекулярного фишинга (рис. 5).

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант РФФИ № 18-04-00071). SPR измерения выполнены на оборудовании ЦКП «Протеом человека» при ИБМХ, поддержанном Минобрнауки РФ в рамках соглашения №14.621.21.0017 (идентификатор RFMEFI62117X0017).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или с использованием животных в качестве объектов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ershov, P., Mezentsev, Y., Gnedenko, O., Mukha, D., Yantsevich, A., Britikov, V., Kaluzhskiy, L., Yablokov, E., Molnar, A., Ivanov, A., Lisitsa, A., Gilep, A., Usanov, S., Archakov, A. (2012) Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: experimental simulation and SPR validation. Proteomics, 12(22), 3295-3298. DOI
2. Ivanov, A.S., Medvedev, A., Ershov, P., Molnar, A., Mezentsev, Y., Yablokov, E., Kaluzhsky, L., Gnedenko, O., Buneeva, O., Haidukevich, I., Sergeev, G., Lushchyk, A., Yantsevich, A., Medvedeva, M., Kozin, S., Popov, I., Novikova, S., Zgoda, V., Gilep, A., Usanov, S., Lisitsa, A., Archakov, A. (2014) Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: Practical realization and further SPR validation. Proteomics, 14(20), 2261-2274. DOI
3. Ivanov, A.S., Ershov, P.V., Molnar, A.A., Mezentsev, Yu.V., Kaluzhskiy, L.A., Yablokov, E.O., Florinskaya, A.V., Gnedenko, O.V., Medvedev, A.E., Kozin, S.A., Mitkevich, V.A., Makarov, A.A., Gilep, A.A., Luschik, A.Ya., Gaidukevich, I.V., Usanov S.A. (2016) Direct molecular fishing in molecular partners investigation in protein–protein and protein–peptide interactions. RJBC, 42(1), 14-21. DOI
4. Svirid, A.V., Ershov, P.V., Yablokov, E.O., Kaluzhskiy, L.A., Mezentsev, Y.V., Florinskaya, A.V., Sushko, T.A., Strushkevich, N.V., Gilep, A.A., Usanov, S.A., Medvedev, A.E., Ivanov, A.S. (2017) Direct molecular fishing of new protein partners for human thromboxane synthase. Acta Naturae. 9(4), 92-100.
5. Florinskaya, A., Ershov, P., Mezentsev, Y., Kaluzhskiy, L., Yablokov, E., Medvedev, A., Ivanov, A. (2018) SPR Biosensors in Direct Molecular Fishing: Implications for Protein Interactomics. Sensors (Basel), 18(5), 1616. DOI
6. Gilep, A.A., Guryev. O.L., Usanov, S.A., Estabrook, R.W. (2001) Apo-cytochrome b5 as an indicator of changes in heme accessability: preliminary studies with cytochrome P450 3A4. J. Inorg. Biochem., 87(4), 237-244. DOI
7. Usanov, S.A., Graham, S.E., Lepesheva, G.I., Azeva, T.N., Strushkevich, N.V., Gilep, A.A., Estabrook, R.W., Peterson, J.A. (2002) Probing the interaction of bovine cytochrome P450scc (CYP11A1) with adrenodoxin: evaluating site-directed mutations by molecular modeling. Biochemistry, 41(26), 8310–8320. DOI
8. Sergeev, G.V., Gilep, A.A. & Usanov S.A. (2014) The role of cytochrome b5 structural domains in interaction with cytochromes P450. Biochemistry (Moscow), 79(5), 406-416. DOI
9. Naryzhny, S.N., Maynskova, M.A., Zgoda, V.G., Ronzhina, N.L., Kleyst, O.A., Vakhrushev, I.V., Archakov, A.I. (2016) Virtual-Experimental 2DE Approach in Chromosome-Centric Human Proteome Project. J. Proteome Res., 15(2), 525–530. DOI
10. Mezentsev, Yu.V., Molnar, A.A., Gnedenko, O.V., Krasotkina, Yu.V., Sokolov, N.N., Ivanov, A.S. (2006) Oligomerization of L-asparaginase from Erwinia carotovora. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B, 1(1), 58-67. DOI
11. Mezentsev, Yu.V., Molnar, A.A., Sokolov, N.N., Lisitsina, V.B., Shatskaya, M.A., Ivanov, A.S., Archakov, A.I. (2011) Specificity of Molecular Recognition in Oligomerization of Bacterial L-Asparaginases. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B, 5(2), 124-134. DOI
12. Ershov, P.V., Gnedenko, O.V., Mol'nar, A.A., Lisitsa, A.V., Ivanov, A.S., Archakov, A.I. (2009) Biosensor analysis of interaction of potential dimerization inhibitors with HIV-1 protease. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B, 3(3), 272-288. DOI
13. Ershov, P., Mezentsev, Y., Gilep, A., Usanov, S., Buneeva, O., Medvedev, A., Ivanov, A. (2017) Isatin-induced increase in the affinity of human ferrochelatase and adrenodoxin reductase interaction. Protein Sci., 26(12), 2458-2462. DOI
14. Fleischmann, G., Fisette, O., Thomas, C., Wieneke, R., Tumulka, F., Schneeweiss, C., Springer, S., Schäfer, L.V., Tampé, R. (2015) Mechanistic Basis for Epitope Proofreading in the Peptide-Loading Complex. J. Immunol., 195(9), 4503-4513. DOI