|
Спектрометрическое определение констант ионизации оксимов — реактиваторов холинэстераз при различной температуре Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины, 195043, Санкт-Петербург, Лесопарковая ул., 4; *e-mail: schafer@yandex.ru Ключевые слова: оксимы; спектры поглощения; протолитическая диссоциация; константы ионизации; влияние температуры DOI: 10.18097/BMCRM00097 ВВЕДЕНИЕ
Применение оксимов при лечении отравлений фосфорорганическими соединениями (ФОС) направлено главным образом на дефосфорилирование холинэстераз и восстановление их гидролитической активности в отношении ацетилхолина. Оксим-индуцированная реактивация начинается с нуклеофильной атаки оксимат-иона на фосфорилированный остаток серина активного центра холинэстеразы. Скорость этой реакции прямо пропорциональна концентрации оксимат-ионов, а коэффициент пропорциональности (константа скорости реакции) зависит от структуры оксима, природы фермента, структуры фосфорильного остатка, ковалентно связанного с остатком серина активного центра, а также температуры и состава среды (pH, ионный состав) [1]. В растворах монооксимов находятся в протолитическом равновесии две формы – протонированная и оксимат-ион: $${\rm R}-{\rm C}{\rm H}{\rm =N}-{\rm OH\ }\stackrel{K_a}{\rightleftharpoons}{\rm \ R}-{\rm C}{\rm H}{\rm =N}-{{\rm O}}^{{\rm -}}{\rm +}{{\rm H}}^{{\rm +}}\;\;\;\;(1)$$ или $${\rm OxH}\stackrel{K_a}{\rightleftharpoons}{{\rm Ox}}^{{\rm -}}{\rm +}{{\rm H}}^{{\rm +}}; \;\;\;\;(2)$$ $$K_a={{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]\left[{\rm O}{{\rm x}}^{{\rm -}}\right]}\over {\left[{\rm OxH}\right]}}, \;\;\;\;(3)$$ где Ka – константа ионизации; [H+], [Ox−] и [OxH] – концентрации протонов, оксимат-иона и протонированной формы оксима, соответственно. Диоксимы в растворах могут пребывать в трёх формах, находящихся в равновесии – дипротонированной, монопротонированной и депротонированной: $${\rm HO}-{\rm N=C}{\rm H}-{\rm R}-{\rm C}{\rm H}{\rm =N}-{\rm OH}\ \stackrel{K_{a1}}{\rightleftharpoons}{\rm HO}-{\rm N=C}{\rm H}-{\rm R}-{\rm C}{\rm H}{\rm =N}-{{\rm O}}^{{\rm -}}{\rm +}{{\rm H}}^{{\rm +}}; \;\;\;\;(4)$$ $${{\rm HO}-{\rm N=CH}-{\rm R}-{\rm CH=N}-{\rm O}}^{{\rm -}}\stackrel{K_{a2}}{\rightleftharpoons}{}^-{{\rm O}}\ -{\rm N=CH}-{\rm R}-{\rm CH=N}-{{\rm O}}^{{\rm -}}{\rm +}{{\rm H}}^{{\rm +}} \;\;\;\;(5)$$ или $${\rm Ox}{{\rm H}}_{{\rm 2}}\stackrel{K_{a1}}{\rightleftharpoons}{\rm Ox}{{\rm H}}^{{\rm -}}{\rm +}{{\rm H}}^{{\rm +}}; \;\;\;\;(6)$$ $${\rm Ox}{{\rm H}}^{{\rm -}}\stackrel{K_{a2}}{\rightleftharpoons}{\rm O}{{\rm x}}^{{\rm 2-}}{\rm +}{{\rm H}}^{{\rm +}}; \;\;\;\;(7)$$ $$K_{a1}={{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]\left[{\rm Ox}{{\rm H}}^{{\rm -}}\right]}\over {\left[{\rm Ox}{{\rm H}}_{{\rm 2}}\right]}}; \;\;\;\;(8)$$ $$K_{a2}={{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]\left[{\rm O}{{\rm x}}^{{\rm 2-}}\right]}\over {\left[{\rm Ox}{{\rm H}}^{{\rm -}}\right]}}, \;\;\;\;(9)$$ где Ka1 и Ka2 – константы ионизации; [H+], [Ox2−], [OxH−] и [OxH2] – концентрации протонов, депротонированной, монопротонированной и дипротонированной форм оксима, соответственно.Известно, что константы ионизации варьируют с изменением температуры различно для разных веществ [2], а влияние температуры на величины констант ионизации оксимов остаётся неизвестным. Следует заметить, что большинство авторов исследуют кислотно-основные свойства оксимов in vitro, как правило, при температуре 25°C [3-5], а их реактивирующую способность в отношении фосфорилированных ферментов – при 37°C [6]. В результате сопоставление данных, полученных в таких разных условиях, представляется не совсем корректным. Таким образом, целью работы было определение значений констант ионизации оксимов – реактиваторов холинэстераз в водных растворах при различной температуре. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали субстанции оксимов (рис. 1), синтезированные в Государственном научно-исследовательском испытательном институте военной медицины МО РФ Л.В. Павловой и И.В. Лагодой; доля основного вещества составляла не менее 98%.
Буферные растворы с pH 5 – 8 готовили, смешивая 0.05 М растворы KH2PO4 и Na2HPO4. Буферные растворы с pH 9 – 12 получали, добавляя к фосфатному буферу (pH 8) 1 н. раствор NaOH. Конечная концентрация монооксимов в растворах составляла 5.0·10−5 М или 1.0·10−4 М, биспиридиниевых диальдоксимов – 2.5·10−5 М или 5.0·10−5 М. Оптическую плотность растворов оксимов температурой 20°C, 25°C или 37°C регистрировали с помощью спектрофотометра Hitachi U2300 при длине оптического пути 1 см, длине волны (λ) от 190 нм до 450 нм против соответствующего буферного раствора той же температуры. Значения длин волн максимумов поглощения определяли визуально, анализируя графики зависимости оптической плотности от длины волны. Статистическую обработку и визуализацию данных выполняли в среде статистического программирования R [7, 8]. РЕЗУЛЬТАТЫ Электронные спектры поглощения каждого из исследованных оксимов содержали две основные полосы поглощения, величины амплитуды которых существенно зависели от pH среды (примеры спектров, полученных при температуре 37°C, представлены на рис. 2 и 3).
Полоса с пиком в длинноволновом диапазоне (от λ = 278 нм у изонитрозина до λ = 376 нм у метоксима) была вызвана поглощением оксимат-ионов –R–CH=N–O−, а полоса в более коротковолновой области (от λ = 228 нм у изонитрозина и до λ = 306 нм у карбоксима) – поглощением оксимных групп –R–CH=N–OH. Значения λmax, приведенные в таблице 1, не зависели от температуры. В кислой среде преобладало поглощение оксимных групп, а в щелочной — оксимат-ионов.
Из уравнения материального баланса, закона Бугера — Ламберта — Бера, правила аддитивности оптических плотностей, уравнений (2, 3) и (6–9) получили выражения, связывающие оптическую плотность A с суммарной концентрацией всех форм оксима [Oxim], молярными коэффициентами светопоглощения ε каждой формы оксима, константами ионизации и концентрацией протонов, для монооксимов (10) и диоксимов (11). $$A{\rm =\ }{{\left[{\rm Oxim}\right]{\rm (}K_a\varepsilon_{{{\rm Ox}}^{{\rm -}}}{\rm \ +\ }\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]\varepsilon_{{\rm OxH}}{\rm )}}\over {K_a{\rm +[}{{\rm H}}^{{\rm +}}{\rm ]}}}\;\;\;\;(10)$$ $$A{\rm =}{{\left[{\rm Oxim}\right]\left(K_{a1}{K_{a2}\varepsilon}_{{{\rm Ox}}^{{\rm 2-}}}{\rm \ +\ }K_{a1}\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]\varepsilon_{{{\rm OxH}}^{{\rm -}}}{\rm \ +\ }{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]}^{{\rm 2}}\varepsilon_{{{\rm OxH}}_{{\rm 2}}}\right)}\over {K_{a1}{\rm \ }K_{a2}{\rm +\ }K_{a1}\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]{\rm \ +\ }{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]}^{{\rm 2}}}}\;\;\;\;(11)$$Используя экспериментально полученные значения оптической плотности растворов оксимов различной кислотности при λmax оксимат-ионов (табл. 1), и зависимости, выраженные уравнениями (10) и (11), методом нелинейной регрессии на основе алгоритма Левенберга — Марквардта [9] получили оценки величин молярных коэффициентов светопоглощения ε форм оксимов и констант их ионизации Ka для монооксимов или Ka1 и Ka2 для диальдоксимов. Рассчитывали величины pKa — отрицательный десятичный логарифм значения константы (табл. 2 и 3).
Молярные коэффициенты светопоглощения существенно не зависели от температуры, а константы ионизации при изменении температуры от 20°C до 37°C возрастали в 1.36 – 1.56 раза (табл. 2 и 3); зависимость pKa, pKa1, pKa2 от температуры была близка к линейной (табл. 4).
Для выяснения вопроса о количественном влиянии температуры на долю нуклеофильных форм в общей концентрации оксима в растворе выполнили следующие вычисления. Для монооксимов из уравнения (3) и уравнения материального баланса следует, что доля оксимат-иона от общей концентрации оксима в растворе выражается уравнением (12). $${{{{\rm [}{\rm Ox}}^{{\rm -}}{\rm ]}}\over {{{\rm [}{\rm Ox}}^{{\rm -}}{\rm ]+[}{\rm OxH}{\rm ]}}}{\rm =}{{K_a}\over {K_a{\rm +\ }{{\rm H}}^{{\rm +}}}}\;\;\;\;(12)$$ В растворах диальдоксимов из уравнений (8) и (9) и уравнения материального баланса долю монопротонированной формы можно найти из уравнения (13), а долю депротонированной – из уравнения (14). $${{{{\rm [}{\rm HOx}}^{{\rm -}}{\rm ]}}\over {{{\rm [}{\rm Ox}}^{{\rm 2-}}{\rm ]+}\left[{\rm OxH}\right]{\rm +[}{{\rm OxH}}_{{\rm 2}}{\rm ]}}}{\rm =}{{K_{a1}{\rm [}{{\rm H}}^{{\rm +}}{\rm ]}}\over {{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]}^{{\rm 2}}{\rm +\ }K_{a1}{\rm \ }\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]{\rm \ +\ }K_{a1}K_{a2}}}\;\;\;\;(13)$$ $${{{{\rm [}{\rm Ox}}^{{\rm 2-}}{\rm ]}}\over {{{\rm [}{\rm Ox}}^{{\rm 2-}}{\rm ]+}\left[{\rm OxH}\right]{\rm +[}{{\rm OxH}}_{{\rm 2}}{\rm ]}}}{\rm =}{{K_{a1}K_{a2}}\over {{\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]}^{{\rm 2}}{\rm +\ }K_{a1}{\rm \ }\left[{{\rm H}}^{{\rm +}}\right]{\rm \ +\ }K_{a1}K_{a2}}}\;\;\;\;(14)$$ На основе результатов этих вычислений для растворов с pH = 7.3 и pH = 7.4 построен рисунок 4.
ОБСУЖДЕНИЕ
Из полученных данных (табл. 2 и 3) и выполненных на их основе расчётов (рис. 4) следует, что концентрация ионизированных оксимных групп, обладающих нуклеофильными свойствами, и, следовательно, реактивирующая способность оксимов в отношении фосфорилированных ферментов положительно зависит не только от pH среды, но и от температуры. В раннем периоде тяжёлых острых отравлений ФОС отмечают ацидоз [10–12]. Кроме того, интоксикация ингибиторами холинэстераз приводит к нарушению холинэргических механизмов, лежащих в основе системы терморегуляции. Это сопровождается развитием гипотермии при тяжёлых отравлениях у мелких лабораторных животных — крыс и мышей, наиболее часто используемых в качестве экспериментальных объектов для моделирования отравлений; описаны случаи гипотермии и в ранние сроки течения отравлений ФОС людей [13–15]. В эти же сроки применяют реактиваторы холинэстераз в составе комплекса средств терапии отравлений [1]. Возможно, недостаточная эффективность оксимов при отравлениях ФОС [16, 17] в ряде случаев обусловлена смещением протолитического равновесия при ацидозе и гипотермии в сторону протонированных форм (рис. 4). Гипотезы о влиянии температуры на скорость реактивации оксимами холинэстераз, ингиброванных ФОС, и о снижении положительного эффекта терапии оксимами — реактиваторами ХЭ на фоне ацидоза и гипотермии требуют проверки в опытах in vitro и в экспериментах на лабораторных животных. ЛИТЕРАТУРА
|
