Сравнительный SPR анализ межмолекулярных взаимодействий с использованием оригинального чипа BIACORE CM5 и его аналога CMD500M

О.В. Гнеденко*, П.В. Ершов, Ю.В. Мезенцев, Л.А. Калужский, Е.О. Яблоков, А.А. Гилеп, А.С. Иванов

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича,
119121, Москва, Погодинская ул., 10; *e-mail: gnedenko.oksana@gmail.com

Ключевые слова: поверхностный плазмонный резонанс (SPR); карбоксиметилированный декстран; взаимодействие антиген-антитело; кинетические константы (k_on, k_off); равновесная константа диссоциации (K_d); чипы CM5 и их аналоги CMD500M

DOI: 10.18097/BMCRM00220

ВВЕДЕНИЕ

С момента появления первых оптических биосенсоров, работающих на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от английского Surface Plasmon Resonance), прошло более 30 лет и в настоящее время они являются основной технологией для регистрации межмолекулярных взаимодействий. Принцип SPR анализа основан на прямой регистрации в реальном времени взаимодействия свободно плавающего в жидкости молекулярного партнера (аналита) с иммобилизованным на поверхности оптического чипа вторым партнером (лигандом) по изменению коэффициента преломления у поверхности чипа [1-5]. В течение трех десятилетий несомненным лидером в области SPR были шведские биосенсоры типа Biacore (в настоящее время бренд принадлежит фирме “Cytiva”, США). Данные биосенсоры широко используются для решения разнообразных фундаментальных задач в области биомедицины [6-10], а также прикладных работ в области фармакологии для идентификации биологически активных соединений как кандидатов для создания мишень-специфичных лекарств [11, 12], биотерапевтических препаратов [13, 14] и ингибиторов целевых белок-белковых взаимодействий [15].

Работа SPR биосенсоров типа Biacore основана на использовании сменных одноразовых оптических чипов, стоимость которых составляет значимую часть бюджета лабораторий, имеющих данные биосенсоры. В настоящее время, в связи с санкционными ограничениями, в РФ отсутствует возможность закупки расходных материалов для имеющегося оборудования производства “Cytiva” (США). Поэтому для пользователей биосенсоров Biacore крайне актуален вопрос обеспечения их дальнейшей работы с использованием совместимых аналогов расходных материалов и в первую очередь оптических чипов.

Существуют два варианта решения данного вопроса: 1) использование совместимых с биосенсорами Biacore чипов-аналогов, выпускаемых фирмой “XanTec bioanalytics GmbH” (Германия) (далее “XanTec”); 2) замена пользователем старого оптического элемента в использованном оригинальном чипе на новый, выпускаемый фирмой “Sofchip” (США). В данной работе нами рассмотрен первый вариант - использование чипов-аналогов фирмы “XanTec”. Реализация второго варианта с заменой оптического элемента в чипе Biacore - это отдельная и непростая задача. Демонтаж старого оптического элемента из корпуса чипа и вклеивание на его места нового требует практически ювелирных навыков ручной работы и особой чистоты рабочего места, так как оптический элемент представляет собой очень тонкую стеклянную пластинку (размеры 9x9x0.3 мм) с напыленным слоем золота и функциональным покрытием (в случае чипов СМ5 - это слой карбоксиметилированного декстрана).

Фирма “XanTec” выпускает чипы-аналоги для оптических биосенсоров разных производителей. В научной литературе есть немало работ, выполненных с использованием таких чипов на биосенсорах Reichert [16], Carterra LSA [17], Biacore 3000 [18–20], Biacore T200 [21, 22], Biacore 8K [17], Biacore X100 [23].

Наиболее часто пользователи биосенсоров Biacore используют оптический чип СМ5, который является стандартом для большинства исследований. Фирма “XanTec” выпускает аналог данного чипа с маркировкой CMD500M, который ряд исследователей успешно использует в своих работах вместо стандартного СМ5 [18, 19, 21]. Однако вопрос о сходимости результатов экспериментальных измерений одних и тех же молекулярных взаимодействий, полученных с использованием оригинальных чипов СМ5 и их аналогов CMD500M, оставался не ясен. На сайте “XanTec” имеется очень краткая и неполная информация в виде информационного бюллетеня [23] о результатах сравнительных испытаний чипов СМ5 и CMD500M, выполненных в исследовательском центре канадской фирмы GFB Biopharmaceuticals на биосенсоре Biacore 8K. Однако документ «Test report “XanTec sensor chips”, 2008», на который ссылается фирма “XanTec”, в Интернете отсутствует. Вместе с тем, в научной литературе нами была найдена только одна независимая публикация [24], в которой было выполнено сравнение результатов измерений взаимодействия одной и той же пары белков, бета2-микроглобулина (b2m) и антитела к этому белку (анти-b2m антитело), с использованием чипов Biacore СМ5 и XanTec CMD500M. Авторы показали, что при полной технической совместимости чипов двух производителей наблюдаются явные различия в точности получаемых данных.

Неоднозначность информации о совместимости чипов двух производителей побудила нас выполнить собственный сравнительный SPR анализ сходимости результатов, получаемых с использованием оригинального чипа Biacore CM5 и чипа-аналога XanTec CMD500M. В качестве тестовой белковой пары были использованы белок А и антитело класса иммуноглобулинов G. Данная пара была выбрана как оптимальная по устойчивости к физико-химическим воздействиям, хорошей растворимости в воде и стехиометрии взаимодействия 1:1, что значительно упрощает математический анализ полученных сенсограмм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для анализа взаимодействий антител с иммобилизованным на оптическом чипе белком А был использован оптический биосенсор Biacore X100 (“Cytiva”, США), работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Сигнал биосенсора регистрировали в реальном времени в резонансных единицах RU (1 RU = 1 пг белка на поверхности оптического чипа) в виде сенсограмм. Все измерения проводили при температуре 25°С. В работе использовали оригинальные чипы Biacore CM5 (“Cytiva”, США) и их аналоги CMD500M (“Xantec”, Германия), покрытые карбоксиметилированным декстраном. В соответствии с руководствами фирм-производителей чипы СМ5 и CMD500M хранили при температуре +4°С и -20°С, соответственно.

В работе были использованы следующие реактивы фирмы “Cytiva” (США): рабочий буфер HBS-EP+ (150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0.05% детергент P20, 10 мМ HEPES, pH 7.4), набор для ковалентной иммобилизации белков за первичные аминогруппы (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-HCl (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS), 1 М этаноламин-HCl (pH 8.5), набор 10 мМ ацетатных буферов (рН 4.0, 4.5, 5.0), 10 мМ глициновый буфер (рН 2.5). Белок А был получен от фирмы “Имтек” (Россия). Моноклональные антитела мыши к иммуноглобулинам G человека, изотип IgG2a (кат. № 1G1cc клон 5А9сс) были получены от фирмы “Хайтест” (Россия).

Процедура рН-скаутинга

Для оптимизации протокола иммобилизации белка А в качестве белка-лиганда была выполнена процедура рН-скаутинга на чипах СМ5 и CMD500M (рис. 1). Для этого через измерительную ячейку биосенсора последовательно инжектировали растворы белка А (100 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере с pH 4.0, 4.5, 5.0 в течение 2 мин при скорости потока 10 мкл/мин. В соответствии с инструкциями к чипам от фирм-производителей, в качестве рабочего буфера для чипа СМ5 был использован буфер HBS-EP+, а в случае СМD500M - бидистиллированная вода (ddH₂O). В случае чипа СМ5 после каждой инжекции раствора белка А поверхность чипа регенерировали промывкой рабочим буфером в течение 30 с при скорости потока 10 мкл/мин (рис. 1 А). В случае чипа СМD500M после каждой инжекции раствора белка А поверхность чипа регенерировали инжекциями 1 М раствора этаноламин-HCl (pH 8.5) в течение 30 с при скорости потока 30 мкл/мин (рис. 1 B). Выполнение протокола рН-скаутинга позволило оценить уровень преконцентрации белка A у поверхности чипов и в обоих случаях выбрать оптимальное значение pH 4.5, при котором наблюдался максимальный рост сигнала биосенсора.

Иммобилизация белка А на чипе CM5

Иммобилизацию белка А осуществляли за счет формирования ковалентных связей между карбоксильными группами на поверхности оптического чипа СМ5 и аминогруппами белка А. Для этого карбоксильные группы чипа активировали инжекцией смеси 0.2 М EDC/0.05 М NHS в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин. Инжекцию раствора белка А (100 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4.5) выполняли со скоростью 5 мкл/мин в течение 7 мин. Остаточные непрореагировавшие активные группы на поверхности чипа блокировали инжекцией раствора 1 M этаноламин-HCl (pH 8.5) в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+ (рН 7.4). В результате на поверхности чипа было иммобилизовано примерно 3.0 нг белка А (3000 RU). Сенсограмма иммобилизации представлена на рис. 2A.

Иммобилизация белка А на чип CMD500M

Карбоксильные группы чипа CMD500M активировали инжекцией смеси 0.2 М EDC /0.05 М NHS в течение 10 мин при скорости потока 5 мкл/мин. Инжекцию раствора белка А (100 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4.5) выполняли со скоростью 5 мкл/мин в течение 10 мин. Непрореагировавшие активные группы чипа блокировали инжекцией раствора 1M этаноламин-HCl (pH 8.5) в течение 15 мин при скорости потока 5 мкл/мин. В качестве рабочего буфера была использована бидистиллированная вода. В результате на поверхности чипа было иммобилизовано примерно 3.4 нг белка А (3400 RU) (рис. 2B).

Протоколы иммобилизации белка А на обоих вариантах чипов представлены в табл. 1. Различия протоколов минимальны - в случае чипов CMD500M - более длительные инжекции и использование ddH₂O вместо буфера HBS-EP+. Количество иммобилизованного белка А на чипах двух типов отличается незначительно (не более 12 %).

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 1. Протоколы иммобилизации белка-лиганда (белок А), выполненные в соответствии с рекомендациями фирм-производителей для чипов СМ5 и CMD500M.

Исследование взаимодействия IgG2а с иммобилизованным белком А

Регистрацию взаимодействий антител (IgG2а) с иммобилизованным белком А выполняли в режиме реального времени путём последовательных инжекций растворов IgG2а (в диапазоне концентраций от 10 нМ до 1 мкМ) через рабочий (с белком А) и контрольный (без белка) каналы биосенсора в течение 5 мин при скорости потока 10 мкл/мин. После каждого измерения поверхность оптического чипа регенерировали инжекцией 10 мМ глицинового буфера (pH 2.5) в течение 30 с при скорости потока 30 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+. Серии полученных сенсограмм анализировали с помощью программы Biaevaluation 4.1.1 с использованием модели взаимодействия 1:1 (Langmuir) binding.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате выполненного SPR-анализа были получены наборы сенсограмм взаимодействий антител IgG2а (в диапазоне концентраций от 10 нМ до 1 мкМ) с иммобилизованным на двух типах чипов белком А. Типичные сенсограммы представлены на рис. 3. Величины кинетических констант и равновесной константы диссоциации комплексов, рассчитанные из экспериментальных кривых согласно модели 1:1 (Langmuir) binding представлены в табл. 2. Можно видеть, что отличия в значениях констант, полученных на чипах от разных производителей, незначительны: значения константы скорости ассоциации (k_on) различаются на 18%, значения константы скорости диссоциации (k_off) - на 10%, а значения равновесной константы диссоциации (K_d) - на 9%.

Закрыть окно ОТКРЫТЬ В ПОЛНОМ РАЗМЕРЕ

Таблица 2. Кинетические параметры и равновесная константа диссоциации комплексов антител IgG2а с иммобилизованным белком А.

В публикации [23] авторы в сравнительном исследовании чипов CM5 и CMD500M обнаружили значительные различия как в уровнях иммобилизации белка-лиганда, так и в величинах кинетических констант и равновесной константы диссоциации. Различие в уровнях иммобилизации приводит также к различию в значениях R_max (максимально возможного сигнала биосенсора при насыщении лиганда), определенных из экспериментальных кривых. R_max был выше в случае чипа CMD500М по сравнению с чипом СМ5. В нашем исследовании мы также наблюдали более высокий Rmax (на 11%) в случае чипа CMD500М от “XanTec” по сравнению с СМ5 (11000 RU против 9800 RU).

Значения кинетических констант и равновесной константы диссоциации комплексов PD-1/анти-PD-1 (рецептор программируемой гибели клеток 1/моноклональные антитела к нему), измеренные на Biacore 8K с использованием чипа CMD200M (“XanTec”), практически накладываются на значения, измеренные на сенсорном чипе CM5 (“Cytiva”) [17]. Полученные нами результаты сходны с этим и показывают небольшую разницу между одинаковыми типами чипов от разных поставщиков.

Наши данные свидетельствуют о том, что чипы CM5 и CMD500M взаимозаменяемые, так как позволяют выполнять исследования на одном и том же приборе с отличиями от 9 % до 18 % в уровнях ковалентной иммобилизации белка и в параметрах белок-белковых взаимодействий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами было выполнено сравнительное исследование межмолекулярных взаимодействий с использованием оригинального оптического чипа CM5 (“Cytiva”) и его аналога CMD500M (“XanTec bioanalytics GmbH”). Это исследование будет полезно пользователям биосенсоров Biacore, работающим в условиях санкций. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что чипы CMD500M “Xantec” можно использовать для работы на SPR биосенсорах типа Biacore. Результаты анализа одних и тех же белок-белковых взаимодействий в этом случае могут отличаться не более чем на 18%. Таким образом, данное исследование подтвердило практически полную взаимозаменяемость оригинальных SPR чипов CM5 (“Cytiva”) и их аналогов CMD500M (“XanTec bioanalytics GmbH”).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или с использованием животных в качестве объектов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа была выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021 - 2030 годы) (№122030100168 2).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Karlsson, R. (2004) SPR for molecular interaction analysis: a review of emerging application areas. Journal of molecular recognition: JMR, 17(3), 151–161. DOI
2. Jason-Moller, L., Murphy, M., Bruno, J. (2006) Overview of Biacore systems and their applications. Current Protocols in Protein Science, Chapter 19, Unit 19.13. DOI
3. Florinskaya, A., Ershov, P., Mezentsev, Y., Kaluzhskiy, L., Yablokov, E., Medvedev, A., Ivanov, A. (2018) SPR biosensors in direct molecular fishing: implications for protein interactomics. Sensors, 18(5), 1616. DOI
4. Liu, H., Fu, Y., Yang, R., Guo, J., Guo, J. (2023) Surface plasmonic biosensors: principles, designs and applications. The Analyst, 148(24), 6146–6160. DOI
5. Douzi, B. (2024) Surface plasmon resonance: a sensitive tool to study protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2715, 363–382. DOI
6. Yablokov, E.O., Sushko, T.A., Ershov, P.V., Florinskaya, A.V., Gnedenko, O.V., Shkel, T.V., Grabovec, I.P., Strushkevich, N.V., Kaluzhskiy, L.A., Usanov, S.A., Gilep, A.A., Ivanov, A.S. (2019) A large-scale comparative analysis of affinity, thermodynamics and functional characteristics of interactions of twelve cytochrome P450 isoforms and their redox partners. Biochimie, 162, 156–166. DOI
7. Ershov, P.V., Kaluzhskiy, L.A., Yablokov, E.O., Gnedenko, O.V., Kavaleuski, A.A., Tumilovich, A.M., Gilep, A.A., Strushkevich, N.V., Ivanov, A.S. (2021) Application of the SPR biosensor for the analysis of protein–protein interactions in aqueous environment and bilayer lipid membrane as exemplified by P450scc (CYP11A1). Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 15(1), 89–96. DOI
8. Kaluzhskiy, L., Ershov, P., Yablokov, E., Shkel, T., Grabovec, I., Mezentsev, Y., Gnedenko, O., Usanov, S., Shabunya, P., Fatykhava, S., Popov, A., Artyukov, A., Styshova, O., Gilep, A., Strushkevich, N., Ivanov, A. (2021) Human lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51A1) is a putative target for natural flavonoid luteolin 7,3′-disulfate. Molecules, 26(8), 2237. DOI
9. Ershov, P.V., Yablokov, E., Zgoda, V., Mezentsev, Y., Gnedenko, O., Kaluzhskiy, L., Svirid, A., Gilep, A., Usanov, S.A., Ivanov, A. (2021) A new insight into subinteractomes of functional antagonists: Thromboxane (CYP5A1) and prostacyclin (CYP8A1) synthases. Cell Biology International, 45(6), 1175–1182. DOI
10. Gilep, A., Varaksa, T., Bukhdruker, S., Kavaleuski, A., Ryzhykau ,Y., Smolskaya, S., Sushko, T., Tsumoto, K., Grabovec, I., Kapranov, I., Okhrimenko, I., Marin, E., Shevtsov, M., Mishin, A., Kovalev, K., Kuklin, A., Gordeliy, V., Kaluzhskiy, L., Gnedenko, O., Yablokov, E., Ivanov, A., Borshchevski,y V., Strushkevich, N. (2023) Structural insights into 3Fe–4S ferredoxins diversity in M. tuberculosis highlighted by a first redox complex with P450. Frontiers in Molecular Biosciences, 9, 1100032. DOI
11. Shepherd, C., Robinson, S., Berizzi, A., Thompson, L.E J., Bird, L., Culurgioni, S., Varzandeh, S., Rawlins, P.B., Olsen, R.H.J., Navratilova, I.H. (2022) Surface plasmon resonance screening to identify active and selective adenosine receptor binding fragments. ACS medicinal chemistry letters, 13(7), 1172–1181. DOI
12. Zhang, X., Sun, L., Meuser, M.E., Zalloum, W.A., Xu, S., Huang, T., Cherukupalli, S., Jiang, X., Ding, X., Tao, Y., Kang, D., De Clercq, E., Pannecouque, C., Dick, A., Cocklin, S., Liu, X., Zhan, P. (2021) Design, synthesis, and mechanism study of dimerized phenylalanine derivatives as novel HIV-1 capsid inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry, 226, 113848. DOI
13. Wang, W., Thiemann, S., Chen, Q. (2022) Utility of SPR technology in biotherapeutic development: Qualification for intended use. Analytical Biochemistry, 654, 114804. DOI
14. Matharu, Z., Bee, C., Schwarz, F., Chen, H., Tomlinson, M., Wu, G., Rakestraw, G., Hornsby, M., Drake, A., Strop, P., Rajpal, A., Dollinger, G. (2021) High-throughput surface plasmon resonance biosensors for identifying diverse therapeutic monoclonal antibodies. Analytical Chemistry, 93(49), 16474–16480. DOI
15. Zhu, Z.-L., Qiu, X.-D., Wu, S., Liu, Y.-T., Zhao, T., Sun, Z.-H., Li, Z.-R., Shan, G.-Z. (2020) Blocking Effect of Demethylzeylasteral on the Interaction between Human ACE2 Protein and SARS-CoV-2 RBD Protein Discovered Using SPR Technology. Molecules (Basel, Switzerland), 26(1), 57. DOI
16. Risse, F., Gedig, E.T., Gutmann, J.S. (2018) Carbodiimide-mediated immobilization of acidic biomolecules on reversed-charge zwitterionic sensor chip surfaces. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 410(17), 4109–4122. DOI
17. Brown, M.E., Bedinger, D., Lilov, A., Rathanaswami, P., Vásquez, M., Durand, S., Wallace-Moyer, I., Zhong, L., Nett J. H., Burnina, I., Caffry, I., Lynaugh, H., Sinclair, M., Sun, T., Bukowski, J., Xu, Y., Abdiche, Y. N. (2020) Assessing the binding properties of the anti-PD-1 antibody landscape using label-free biosensors. PloS One, 15(3), e0229206. DOI
18. Chen, Q., Manzke, M., Hartmann, A., Büttner, M., Amann, K., Pauly, D., Wiesener, M., Skerka, C., Zipfel, P.F. (2016) Complement factor H-related 5-hybrid proteins anchor properdin and activate complement at self-surfaces. Journal of the American Society of Nephrology, 27(5), 1413–1425. DOI
19. Fu, Z., Xu, Y., Cai, C. (2021) Ginsenoside Rg3 inhibits pulmonary fibrosis by preventing HIF-1α nuclear localisation. BMC Pulmonary Medicine, 21(1), 70. DOI
20. Di Primo, C., Dausse, E., Toulmé, J.-J. (2011) Surface plasmon resonance investigation of RNA aptamer–RNA ligand interactions. In J. Goodchild (Ed.), Therapeutic Oligonucleotides (Vol. 764, pp. 279–300). Totowa, NJ: Humana Press. DOI
21. Desmyter, A., Farenc, C., Mahony, J., Spinelli, S., Bebeacua, C., Blangy, S., Veesler, D., Van Sinderen, D., Cambillau, C. (2013) Viral infection modulation and neutralization by camelid nanobodies. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(15). DOI
22. Rohlik, D. L., Patel, E., Gilbert, N.C., Offenbacher, A.R., Garcia, B.L. (2023) Investigating membrane-binding properties of lipoxygenases using surface plasmon resonance. Biochemical and Biophysical Research Communications, 670, 47–54. DOI
23. XanTec. Comparison between sensor chips from XanTec and other manufacturers. Newsletter II. Retrieved March 28, 2024, from: https://www.xantec.com/material/pdf/comparison_between_sensorchips_from_xantec_and_other_manufacturers.pdf
24. Steinicke, F., Oltmann-Norden, I., Wätzig, H. (2017) Long term kinetic measurements revealing precision and general performance of surface plasmon resonance biosensors. Analytical Biochemistry, 530, 94–103. DOI