К 40-летию Института физиологически активных веществ РАН
|
СОДЕРЖАНИЕ |
Фармакокинетические исследования лекарственной формы нового стимулятора когнитивных функций мозга OSPL – 502
1Институт физиологически активных веществ Российской академии наук
142432, Черноголовка, Московской обл., Северный проезд, 1; e-mail:
*pukhov.sergey@gmail.com Ключевые слова: фармакокинетика; ноотроп; ВЭЖХ/МС; метаболиты DOI: 10.18097/BMCRM00046 ВВЕДЕНИЕ Целью настоящего исследования было получение количественных характеристик процессов всасывания, распределения и элиминации действующего вещества лекарственной формы нового стимулятора когнитивных функций мозга OSPL – 502, представляющего собой бинарный аллостерический лиганд АМРА-рецепторов на основе производного диазобициклононана (молекулярная формула C25H24N2O7, молекулярный вес составляет 464.46726 г/моль). Получение этих данных позволяет прогнозировать действие препарата у человека для дальнейшего клинического исследования. Дополнительной целью исследования являлось исследование метаболизма действующего вещества лекарственной формы нового стимулятора когнитивных функций мозга OSPL – 502 и обнаружение основных метаболитов. Фармакокинетические исследования необходимы при разработке новых препаратов, их лекарственных форм, а также при экспериментальных и клинических испытаниях лекарственных средств [1]. Процессы, происходящие с лекарственными препаратами в организме, могут быть описаны с помощью ряда параметров. Константы скорости элиминации (Кel), абсорбции (Ка) и экскреции (Кex) характеризуют, соответственно, скорость исчезновения препарата из организма путем биотрансформации и выведения, скорость поступления его из места введения в кровь и скорость выведения с мочой, калом, слюной и др. Период полувыведения (Т1/2) — время, необходимое для уменьшения вдвое концентрации препарата в крови, зависит от константы скорости элиминации (Т1/2 = 0,693/Кel). Период полуабсорбции (Т1/2,a) — время, необходимое для всасывания половины дозы препарата из места введения в кровь, пропорционален константе скорости абсорбции (Т1/2,a = 0,693/Ка). Общий клиренс препарата (Clt) характеризует скорость “очищения” организма от лекарственного препарата. Выделяют почечный (Clr) и внепочечный (Cler) клиренсы, которые отражают выведение лекарственного вещества, соответственно, с мочой и другими путями (прежде всего с желчью). Общий клиренс является суммой почечного и внепочечного клиренса. Площадь под кривой “концентрация - время” (AUC) – площадь фигуры, ограниченной фармакокинетической кривой и осями координат (AUC = C0/Kel). Величина (AUC) связана с другими фармакокинетическими параметрами – объемом распределения, общим клиренсом. При линейности кинетики препарата в организме величина AUC пропорциональна общему количеству (дозе) препарата, попавшего в системный кровоток. Абсолютная биодоступность (f) – часть дозы препарата (в %), которая достигла системного кровотока после внесосудистого введения, равна отношению AUC после введения исследуемым методом (перорально (п/о), внутримышечно и др.) к AUC после внутривенного (в/в) введения. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В экспериментах использовали метанол и ацетонитрил марки ВЭЖХ, ацетат, формиат и гидроксид аммония, уксусную и муравьиную кислоту («Catrosa», Испания), ДМСО («Panreac», Испания). Применялась деионизованная вода, приготовленная с помощью системы WaterPro PS/HPLC/UF («Labconco», США) с сопротивлением не менее 18 МОм. Стандартные растворы препарата готовили путем растворения точных навесок в мерных колбах. Градуировочные графики строили в координатах S (площадь пика) – С (концентрация препарата OSPL–502), г/дм3 в интервале концентраций 0.05 – 0.5 г/дм3. Образцы плазмы крови предварительно пропускали через патроны Isolute PPT+ с помощью аппарата VacMaster («Biotage», Швеция) из расчета 300 мкл ацетонитрила : 100 мкл образца для осаждения белков плазмы [2]. Перед проведением анализа хроматографическую колонку кондиционировали подвижной фазой ацетонитрил : вода (70 : 30 об. %), затем систему промывали фосфатным буфером до установления ровной базовой линии. Стандартные растворы (20 мкл) вводили в хроматограф попеременно через каждые 2 – 3 пробы. Концентрацию соединения OSPL–502 определяли по площади пиков. В эксперименте было использовано 105 крыс (Rattus sp.) линии CD (сток Swiss) возрастом 6 – 8 недель (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН», Россия). Для каждой временной группы использовали по 5 особей, а также 5 особей для контрольной группы. Лекарственную форму нового стимулятора когнитивных функций мозга OSPL–502 вводили п/о и в/в однократно, в дозах – 10 мг/кг и 2 мг/кг в расчете на действующее вещество в 0,5 мл дистиллированной воды с добавлением 1% гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC) и 0,5% Твин–80. В качестве контроля использовали 0,5 мл дистиллированной воды с добавлением 1% гидроксипропилметилцеллюлозы и 0,5% Твин–80. Пробы крови крыс брали из ретроорбитального синуса после эвтаназии животного в СО2–камере через указанные интервалы времени после введения в объеме 5 мл в гепаринизированную пробирку. Для изучения метаболитов исследуемое соединение инкубировали с гомогенатом печени в присутствии соответствующих кофакторов. Гомогенат печени получали из крыс CD (Sprague-Dawley), сток Swiss (пул из пяти самцов) (НПП «Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН») контрольной группы исследования. Печень выделяли и осторожно гомогенизировали на льду с помощью стеклянного гомогенизатора в 1,2% хлорида калия. Соединение растворяли в ДМСО, затем разбавляли, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкМ. Инкубационные смеси содержали 20 мг гомогената печени, 1 мМ NADPH, 1 мМ GSH, 5 мМ UDPGA, 1 мМ PAPS в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4) в общем объеме 500 мкл (40 мг/мл гомогената). Конечное количество ДМСО в инкубационной смеси составило не более 1% (объем/объем). Образцы инкубировали в течение 2 мин в шейкере-инкубаторе ES–20 («Biosan», Латвия) при 37°С, реакцию начинали добавлением кофакторов. Отбирали пробы 100 мкл на 0 и на 60 мин, реакцию останавливали добавлением равного объема, охлажденного льдом ацетонитрила с последующим охлаждением в ледяной бане. Образцы хранили при −20° C, затем оттаивали при комнатной температуре, встряхивали и центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге 5415D («Eppendorf AG», Германия) при 10000 об/мин. Супернатант переносили пипеткой в виаллы для ВЭЖХ/МС. Хроматографическое оборудование и условия В работе использовано оборудование Центра коллективного пользования ИФАВ РАН. Хроматограф Series 200 («PerkinElmer», США) с колонкой Brownlee Choice Basic 150.0 × 4.6 мм, 5 мкм (№1), хроматограф Миллихром А-02 («ЭкоНова», Россия) с колонкой ProntoSIL 120 - 5C18 AQ, 2.0 × 75 мм, 5 мкм (№2). УФ-детектирование осуществляли при 296 нм. Использовали градиентное элюирование: элюент А – 0.2 М фосфатный буфер (рН 2.6), элюент В – ацетонитрил. Скорость элюирования – 1000 мкл/мин для колонки №1 и 100 мкл для колонки №2. УФ-спектры снимали на спектрофотометре Lambda 35 («Perkin Elmer»). Жидкостная хроматография – масс-спектрометрия. Для анализа использовали хромато-масс-спектрометр Finnigan LXQ Surveyor («Thermo», США) с электроспрейной ионизацией и линейной ионной ловушкой, хроматографическую колонку Диасфер-110-С10CN, 2.0 × 80 мм, 5 мкм («БиоХимМак СТ», Россия), элюент – 0.1% уксусная кислота (рН 3.2) и ацетонитрил с градиентным элюированием (до 75% ацетонитрила). Скорость потока составляла 300 мкл/мин, температура термостата колонки 35°С. Лейцин-энкефалин был использован в качестве соединения для калибровки точного измерения массы ([М+Н]+, m/z 556.2771). Метаболиты анализировали с помощью программы MetaboliteID входящий в состав пакета ПО Excalibur («ThermoFisher Scientific», США). РЕЗУЛЬТАТЫ Предварительно был снят УФ-спектр исследуемого вещества в смеси ацетонитрил : 0.2 М фосфатный буфер для определения длины волны поглощения для проведения количественного анализа. В результате анализа спектра была выбрана длина волны 294 нм, как наиболее подходящая для хроматографического количественного анализа. Были подобраны условия хроматографического определения соединения OSPL – 502: наименьшее время хроматографирования и достаточное разделение пика тестируемого вещества и веществ плазмы крови было достигнуто при использовании изократического режима элюирования ацетонитрил : 0.2 М фосфатный буфер (55 : 45 об. %) и скорости элюирования 1000 мкл/мин для колонки №1 и 100 мкл для колонки №2. Калибровочный график в изученном интервале концентраций представлял собой прямую линию (Kкорр. = 0.987) описываемую уравнением С = 0.143 × h, где С – концентрация соединения OSPL – 502 в сыворотке крови (в нг/мл), h – высота хроматографического пика (в мм). Калибровочные кривые строили по результатам хроматографического анализа на основе измерений высот хроматографических пиков. Результаты анализа контрольных образцов вносили в таблицу, рассчитывали средние значения, стандартные ошибки и затем строили калибровочный график. Порог чувствительности метода (абсолютная чувствительность по соединению OSPL – 502 в анализируемой пробе) составляла не ниже 0.5 нг соединения в 1 мл сыворотки крови. Относительная ошибка определения составила 8.79 % при концентрации препарата 15 нг/мл. Далее анализировали пробы плазмы крови, взятые в соответствующие временные интервалы (табл. 1).
Основные фармакокинетические параметры лекарственной формы соединения OSPL – 502, полученные в результате исследования, приведены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, экспериментальные значения концентраций соединения OSPL – 502 в плазме крови крыс удовлетворительно соответствует концентрациям, рассчитанным по уравнению соответствующей модели. Учитывая данные о внутривенном определении концентрации соединения OSPL – 502 (AUC0-48 при внутривенном введении в дозе 2 мг/кг равно 962.6), возможно рассчитать биодоступность соединения OSPL – 502 по формуле:
Таким образом, рассчитанная биодоступность соединения OSPL – 502 при п/о введении лекарственной формы в пересчете на субстанцию в дозе 10 мг/кг для крыс составляет 50.65%. Определение метаболитов соединения OSPL – 502 При инкубации с гомогенатом печени в течение 60 мин в присутствии кофакторов около 70% соединения OSPL – 502 оставалось в пробе. Уменьшение концентрации соединения OSPL – 502 при инкубации без кофакторов не наблюдалось. Таким образом, метаболизм соединения OSPL – 502 является кофактор-зависимым. Данные по определению соединения OSPL – 502 и его метаболитов при помощи ВЭЖХ/ESI-MS приведены в таблице 3. Обнаруженные соединения идентифицированы в соответствии с точными массовыми данными и временами удерживания. Было обнаружено шестнадцать метаболитов соединения OSPL – 502. Метаболиты М1 – М4, по-видимому, образованы путем гидроксилирования (или N-окисления), М5 – M7 через моно- или дигидрирование, а M8 – M9 посредством комбинации этих метаболических реакций. Метаболит M10, в свою очередь, является глюкуронидом метаболитов M5 или M6. Метаболит M11 был образован путем O-,O-деметилирования (потеря углерода из диоксольного фрагмента с образованием пирокатехиновой структуры). Метаболит M12 является результатом дальнейшего гидрирования метаболитов M11 и M13, в то время как метаболит M14 – продукт глюкуронизации метаболита M11. На основании полученных точных данных молекулярных масс, метаболит M15 был предположительно идентифицирован как результат гидроксилирования и глюкуронизации молекулы M12, а метаболит M16 – дальнейшего гидроксилирования и S-глутатион-конъюгации с метаболитом M12.
Вследствие высокосимметричной структуры исследованного соединения существуют различные возможности для образования каждого обнаруженного фрагментного иона, из-за которого установление участка биотрансформации может быть неоднозначным. Однако в случае гидроксиметаболитов M1 – M4 наблюдались фрагмент-ионы из немодифицированного бензодиоксола (m/z 149, тогда как гидроксилированный бензодиоксол при m/z 165 не наблюдался). Это может указывать на то, что основной сайт биотрансформации, скорее всего, является центральным кольцом молекулы (диазобициклонан) и метильными группами при нем (M1, M2). Более того, повышенное время хроматографического удерживания метаболитов M3 и M4 по отношению к исходной молекуле свидетельствует о том, что эти метаболиты, возможно, были образованы за счет N-окисления (а не карбоксилированием). Для M6 наблюдался фрагмент-ион из-за гидрированной бензодиоксольной области (при m/z 151), указывающий либо на ее гидрирование, либо на восстановление кетогруппы. Необходимо отметить, что идентификация подобных метаболитов не может быть строго однозначной, так как неизбежным является потеря определенных фрагментных ионов. На основании анализа относительных площадей пиков ионов в ВЭЖХ/ESI – MS, метаболиты M2 и M6 являются основными, с 35 % и 16 % соответственно, от общей площади пика метаболитов соединения OSPL – 502. Метаболиты М1, М5 и М10 представлены 7 – 10 % от общей площади пика исследуемого ноотропа. ОБСУЖДЕНИЕ Результаты анализа экспериментальных данных показали, что динамика концентрации соединения OSPL – 502 в плазме крови крыс при п/о введении лекарственной формы удовлетворительно апроксимируется уравнением одночастевой модели с учетом всасывания. Анализ полученных данных показывает, что соединение OSPL – 502 достаточно быстро всасывается при внесосудистом п/о способе его введения крысам, об этом же свидетельствует и время достижения максимальной концентрации препарата в крови. Рассчитанная биодоступность соединения OSPL – 502 при п/о введении лекарственной формы в пересчете на субстанцию в дозе 10 мг/кг для крыс составляет 50.65 %. В процессе метаболизма препарата выделяют две основные фазы. В ходе фазы I метаболизма (несинтетические реакции) к молекуле соединения присоединяется функциональная группа, например: –ОН, –NH2, –SH, либо эта группа становится доступной в результате химических превращений. Основные реакции фазы I – реакции окисления, из которых наиболее распространены реакции гидроксилирования. К менее частым реакциям фазы I относят процессы восстановления и гидролиза. В ходе фазы II (синтетические реакции) образуется ковалентная связь между функциональной группой препарата или его метаболита и эндогенными соединениями: глюкуроновой кислотой, сульфатом, ацетатом, глутатионом, аминокислотами. Глюкуронизация является основным путем биотрансформации препаратов у многих видов млекопитающих за исключением семейства кошачьих. Как правило, только после II фазы биотрансформации образуются неактивные или малоактивные соединения, поэтому именно синтетические реакции можно считать истинными реакциями детоксикации ксенобиотиков, в том числе и лекарственных соединений. Методы in vitro, в частности, инкубация соединения с гомогенатом печени, рассматриваются как альтернативная возможность определения метаболизма лекарственных препаратов в организме животных [4]. Учитывая все выше сказанное, нами были проанализированы возможные метаболиты соединения OSPL – 502. На основании проведенных исследований метаболизма нового стимулятора когнитивных функций мозга OSPL – 502 можно сделать следующие выводы:
БЛАГОДАРНОСТИ Работа выполнена в рамках Госзадания 0090-2017-0018. ЛИТЕРАТУРА
|
