Оптимизация протокола получения экзосом и секретома клеток колоректальной аденокарциномы линии CACO-2 из кондиционированной среды для последующего масс-спектрометрического анализа

##plugins.themes.bootstrap3.article.sidebar##

pdf html html (English) Supplementary (English)
Опубликован: Apr 16, 2020
DOI: https://doi.org/10.18097/BMCRM00118
Ключевые слова:
протеомика; масс-спектрометрия; внеклеточные везикулы; секретом; экзосомы

##plugins.themes.bootstrap3.article.main##

Н.А. Шушкова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
С.Е. Новикова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Т.Е. Фарафонова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
В.Г. Згода
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10

Аннотация

Кондиционированная среда, в которой культивируют опухолевые клетки, служит модельным объектом для исследования секретома и протеомного состава экзосом. Данный пул белков представляет особый интерес с точки зрения поиска потенциальных маркеров злокачественных заболеваний. Эффективность выделения экзосом и секретома из среды культивирования клеток во многом определяет успешность их анализа масс-спектрометрическим методом. В данной работе мы применили различные подходы к выделению секретома и экзосом линии колоректальной аденокарциномы Caco-2. Сочетание ультрафильтрации и центрифугирования обеспечило глубокий протеомный анализ секретома и экзосом, полученных из одного начального объема кондиционированной среды без добавления фетальной бычьей сыворотки. Панорамный масс-спектрометрический анализ позволил идентифицировать 436 секретируемых белков. В экзосомах были идентифицированы характерные белки ALIX, СD63, синтенин, лактадгерин (MFGE8). С применением таргетной масс- спектрометрии были определены маркеры экзосом CD82, CD9 и HSPA8 на уровне 0.08±0.03 фмоль/мкг, 0.13±0.03 фмоль/мкг и 2.6±0.02 фмоль/мкг общего белка соответственно. Среди секретируемых белков оказалось множество маркеров, ассоциированных с опухолевой прогрессией и метастазированием, таких как DAG1, PODXL, LRRN4, TGFBI, IL6ST, DSC1, DSG1и NPC2.

##plugins.themes.bootstrap3.article.details##

Как цитировать
Шушкова N., Новикова S., Фарафонова T., & Згода V. (2020). Оптимизация протокола получения экзосом и секретома клеток колоректальной аденокарциномы линии CACO-2 из кондиционированной среды для последующего масс-спектрометрического анализа. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 3(1), e00118. https://doi.org/10.18097/BMCRM00118
Выпуск
Том 3 № 1 (2020)
Раздел
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Библиографические ссылки

  1. Bettger W.J., McKeehan W.L. (1986) Mechanisms of cellular nutrition. Physiol. Rev., 66(1), 1-35. DOI
  2. Severino V., Farina A., Chambery A. (2013) Analysis of secreted proteins. Methods Mol. Biol., 1002, 37-60. DOI
  3. Bosse K., Haneder S., Arlt C., Ihling C.H., Seufferlein T., Sinz A. (2016) Mass spectrometry-based secretome analysis of non-small cell lung cancer cell lines. Proteomics, 16(21), 2801-2814. DOI
  4. Lobb R.J., Becker M., Wen S.W., Wong C.S., Wiegmans A.P., Leimgruber A., Möller A. (2015) Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J. Extracell. Vesicles, 4, 27031. DOI
  5. Wessel D., Flügge U.I. (1984) A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem, 138(1), 141-143.
  6. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem, 68(5), 850-858.
  7. Wiśniewski J.R., Zougman A., Nagaraj N., Mann M. (2009) Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods, 6(5), 359-362. DOI
  8. Shushkova N.A., Vavilov N.E., Novikova S.E., Farafonova T.E., Tikhonova O.V., Liao P.C., Zgoda V.G. (2018) Quantitative proteomics of human blood exosomes. Biomed. Khim. 64(6), 496-504. DOI
  9. Cox J., Hein M.Y., Luber C.A., Paron I., Nagaraj N., Mann M. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol. Cell Proteomics, 13(9), 2513-2526. DOI
  10. Kopylov A.T., Ponomarenko E.A., Ilgisonis E.V., Pyatnitskiy M.A., Lisitsa A.V., Poverennaya E.V., Kiseleva O.I., Farafonova T.E., Tikhonova O.V., Zavialova M.G., Novikova S.E., Moshkovskii S.A., Radko S.P., Morukov B.V., Grigoriev A.I., Paik Y.K., Salekdeh G.H., Urbani A., Zgoda V.G., Archakov A.I. (2018) Targeted Quantitative SRM SIS Screening of Chromosomes 18, 13, Y, and the Mitochondrial Chromosome Encoded Proteome. J. Proteome Res. American Chemical Society, 18(1), 120-129, DOI
  11. Jeppesen D.K., Nawrocki A., Jensen S.G., Thorsen K., Whitehead B., Howard K.A., Dyrskjot L., Orntoft T.F., Larsen M.R., Ostenfeld M.S. (2014) Quantitative proteomics of fractionated membrane and lumen exosome proteins from isogenic metastatic and nonmetastatic bladder cancer cells reveal differential expression of EMT factors. Proteomics, 14(6), 699–712, DOI
  12. Shushkova N.A., Novikova S.E., Zgoda V.G. (2019) Exosomes of malignant tumors: prospects of omiсs diagnostics. Biomeditsinskaya khimiya, 65(6), 457-467.
  13. Braun F., Bertin-Ciftci J., Gallouet A.S., Millour J., Juin P., (2011) Serum-nutrient starvation induces cell death mediated by bax and puma that is counteracted by p21 and unmasked by Bcl-x L inhibition. PLoS One, 6(8), DOI
  14. García-Lorenzo A., Rodríguez-Pineiro A.M., Rodríguez-Berrocal F.J., Cadena M.P., Martínez-Zorzano V.S. (2012) Changes on the Caco-2 secretome through differentiation analyzed by 2-D differential in-gel electrophoresis (DIGE). Int. J. Mol. Sci., 13(11), 14401–14420, DOI