Температурная зависимость коллатеральной активности термостабильных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b, полученных одностадийной очисткой металл-хелатной хроматографией после гетерологической экспрессии

##plugins.themes.bootstrap3.article.sidebar##

pdf html html (English)
Опубликован: Oct 2, 2025
DOI: https://doi.org/10.18097/BMCRM00284
Ключевые слова:
рекомбинантная CRISPR-нуклеаза Cas12b; одностадийная очистка; коллатеральная нуклеазная активность; температурная зависимость

##plugins.themes.bootstrap3.article.main##

Л.К. Курбатов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
О.С. Тимошенко
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
С.А. Хмелева
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
К.Г. Птицын
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
Е.В. Супрун
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы 1/3
С.П. Радько
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
А.В. Лисица
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10

Аннотация

Термостабильные CRISPR/Cas-нуклеазы рассматриваются как перспективные ферменты для создания ДНК-диагностикумов нового поколения путем сопряжения петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) с селективной CRISPR/Cas-детекцией специфичных ампликонов. В настоящей работе представлены результаты тестирования коллатеральной активности CRISPR-нуклеазы AapCas12b и трех вариантов CRISPR-нуклеазы BrCas12b (дикий тип и два мутанта), полученных с использованием упрощенной очистки, в типичном температурном диапазоне проведения LAMP – от 56°С до 72°С. Они показали, что применение одностадийной металл-хелатной хроматографии с исключением этапа энзиматического удаления N-концевых последовательностей, транслируемых вместе с целевым белком, позволяет получать рекомбинантные CRISPR-нуклеазы BrCas12b с достаточно высоким уровнем коллатеральной активности. Температурные зависимости коллатеральной активности различались у исследованных вариантов BrCas12b. Полученные результаты могут быть использованы при выборе термостабильных CRISPR-нуклеаз Cas12b для создания тест-систем на основе комбинирования LAMP и CRISPR/Cas-детекции.

##plugins.themes.bootstrap3.article.details##

Как цитировать
Курбатов L., Тимошенко O., Хмелева S., Птицын K., Супрун E., Радько S., & Лисица A. (2025). Температурная зависимость коллатеральной активности термостабильных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b, полученных одностадийной очисткой металл-хелатной хроматографией после гетерологической экспрессии. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 8(3), e00284. https://doi.org/10.18097/BMCRM00284
Выпуск
Том 8 № 3 (2025)
Раздел
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Библиографические ссылки

  1. van der Oost, J., Westra, E.R., Jackson, R.N., Wiedenheft, B. (2014)Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems.Nature Review Microbiology, 12(7), 479-492. DOI
  2. Kaminski, M.M., Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Zhang, F., Collins, J.J.(2021) CRISPR-based diagnostics. Nature Biomedical Engineering, 5(7), 643-656. DOI
  3. Fapohunda, F.O., Qiao, S., Pan, Y., Wang, H., Liu, Y., Chen, Q., Lu, P.(2022) CRISPR Cas system: A strategic approach in detection of nucleic acids.Microbiological Research, 259, 127000. DOI
  4. Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Lee, J.W., Essletzbichler, P., Dy, A.J.,Joung, J., Verdine, V., Donghia, N., Daringer, N.M., Freije, C.A., Myhrvold, C.,Bhattacharyya, R.P., Livny, J., Regev, A., Koonin, E.V., Hung, D.T., Sabeti, P.C.,Collins, J.J., Zhang, F. (2017) Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. DOI
  5. Chen, J.S., Ma, E., Harrington, L.B., Da Costa, M., Tian, X., Palefsky, J.M.,Doudna, J.A. (2018) CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminatesingle-stranded DNase activity. Science, 360(6387), 436-439. DOI
  6. Piepenburg, O., Williams, C.H., Stemple, D.L., Armes, N.A. (2006) DNAdetection using recombination proteins. PLoS Biology, 4(7), e204. DOI
  7. Khmeleva, S. A., Ptitsyn, K. G., Kurbatov, L. K., Timoshenko, O. S.,Suprun, E. V., Radko, S. P., Lisitsa, A. V. (2024) Biosensing platforms forDNA diagnostics based on CRISPR/Cas nucleases: towards the detectionof nucleic acids at the level of single molecules in non-laboratory settings.Biomeditsinskaya Khimiya, 70(5), 287-303. DOI
  8. Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanab,e K.,Amino, N., Hase, T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research, 28(12), e63. DOI
  9. Joung, J., Ladha, A., Saito, M., Kim, N.G., Woolley, A.E., Segel, M.,Barretto, R.P.J., Ranu, A., Macrae, R.K., Faure, G., Ioannidi, E.I., Krajeski,R.N., Bruneau, R., Huang, M.W., Yu, X.G., Li, J.Z., Walker, B.D., Hung, D.T.,Greninger, A.L., Jerome, K.R., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Zhang, F.(2020) Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. The NewEngland Journal of Medicine, 383(15), 1492-1494. DOI
  10. Teng, F., Cui, T., Feng, G., Guo, L., Xu, K., Gao, Q., Li, T., Li, J., Zhou,Q., Li, W. (2018) Repurposing CRISPR-Cas12b for maмМalian genomeengineering. Cell Discovery, 27(4), 63. DOI
  11. Tian, Y., Liu, R.R., Xian, W.D., Xiong, M., Xiao, M., Li, W.J. (2020) Anovel thermal Cas12b from a hot spring bacterium with high target mismatchtolerance and robust DNA cleavage efficiency. International Journal ofBiological Macromolecules, 147, 376-384. DOI
  12. Nan, X., Hardinge, P., Hoehn, S., Dighe, S.N., Ukeri, J., Pease, D.F., Griffin,J., Warrington, J.I., Saud, Z., Hottinger, E., Webster, G., Jones, D., Kille, P.,Weightman, A., Stanton, R., Castell, O.K., Murray, J.A.H., Jurkowski, T.P.(2023) VarLOCK: sequencing-independent, rapid detection of SARS-CoV-2variants of concern for point-of-care testing, qPCR pipelines and nationalwastewater surveillance. Scientific Reports, 13(1), 20832. DOI
  13. Nguyen, L.T., Macaluso, N.C., Pizzano, B.L.M., Cash, M.N., Spacek, J.,Karasek, J., Miller, M.R., Lednicky, J.A., Dinglasan, R.R., Salemi, M., Jain,P.K. (2022) A thermostable Cas12b from Brevibacillus leverages one-potdiscrimination of SARS-CoV-2 variants of concern. EBioMedicine, 77, 103926. DOI
  14. Nguyen, L.T., Rananaware, S.R., Yang, L.G., Macaluso, N.C., Ocana-Ortiz,J.E., Meister, K.S., Pizzano, B.L.M., Sandoval, L.S.W., Hautamaki, R.C., Fang,Z.R., Joseph, S.M., Shoemaker, G.M., Carman, D.R., Chang, L., Rakestraw,N.R., Zachary, J.F., Guerra, S., Perez, A., Jain, P.K. (2023) Engineering highlythermostable Cas12b via de novo structural analyses for one-pot detection ofnucleic acids. Cell Reports Medicine, 4(5), 101037. DOI
  15. Kurbatov, L.K., Radko, S.P., Kravchenko, S.V., Kiseleva, O. I., Durmanov, N.D., Lisitsa, A. V. (2020) Single Stage Purification of CRISPR/Cas13a Nucleasevia Metal-Chelating Chromatography Following Heterologous Expression withthe Preservation of Collateral Ribonuclease Activity. Applied Biochemistry andMicrobiology, 56(6), 671–677. DOI
  16. Kurbatov, L. K., Radko, S. P., Khmeleva, S. A., Ptitsyn, K. G., Timoshenko,O. S., Lisitsa, A. V. (2024) Application of DETECTR for Selective Detection ofBacterial Phytopathogen Dickeya solani Using Recombinant CRISPR-NucleaseCas12a Obtained by Single-Stage Chromatographic Purification. AppliedBiochemistry and Microbiology, 60(1), 17-25. DOI
  17. Habimana, J.D., Mukama, O., Chen, G., Chen, M., Amissah, O.B., Wang,L., Liu, Y., Sun, Y., Li, A.L., Deng, S., Huang, J., Yan, X.X., Rutaganda, T.,Mutangana, D., Wu, L.P., Huang, R., Li, Z. (2023) Harnessing enhancedCRISPR/Cas12a trans-cleavage activity with extended reporters and reductantsfor early diagnosis of Helicobacter pylori, the causative agent of peptic ulcersand stomach cancer. Biosensors and Bioelectronics, 222, 114939. DOI
  18. Ptitsyn, K. G, Khmeleva, S. A, Kurbatov, L. K, Timoshenko, O. S, Suprun,E. A, Radko, S. P, Lisitsa, A. V. (2024). Lamp Primer Designing Software: TheOverview. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 7(4), e00226. DOI
  19. Kurbatov, L. K., Radko, S. P, Khmeleva, S. A., Timoshenko, O. S. Lisitsa,A. V. (2022) Standardization of Recombinant CRISPR/Cas13a-nucleasePreparations by Using RNase A of Known Activity. Biomedical Chemistry:Research and Methods, 5(4), e00177. DOI
  20. Hand, T.H., Das, A., Li, H. (2019). Directed evolution studies of athermophilic Type II-C Cas9. Methods in Enzymology, 616, 265–288. DOI
  21. Kumar, S., Tsai, C.J., Nussinov, R. (2000) Factors enhancing proteinthermostability. Protein Engineering, 13(3), 179–191. DOI