Температурная зависимость коллатеральной активности термостабильных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b, полученных одностадийной очисткой металл-хелатной хроматографией после гетерологической экспрессии

##plugins.themes.bootstrap3.article.sidebar##

pdf html html (English)
Опубликован: Oct 1, 2025
DOI: https://doi.org/10.18097/BMCRM00284
Ключевые слова:
рекомбинантная CRISPR-нуклеаза Cas12b; одностадийная очистка; коллатеральная нуклеазная активность; температурная зависимость

##plugins.themes.bootstrap3.article.main##

Л.К. Курбатов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
О.С. Тимошенко
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
С.А. Хмелева
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
К.Г. Птицын
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
Е.В. Супрун
Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы 1/3
С.П. Радько
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10
А.В. Лисица
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10

Аннотация

Термостабильные CRISPR/Cas-нуклеазы рассматриваются как перспективные ферменты для создания ДНК-диагностикумов нового поколения путем сопряжения петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) с селективной CRISPR/Cas-детекцией специфичных ампликонов. В настоящей работе представлены результаты тестирования коллатеральной активности CRISPR-нуклеазы AapCas12b и трех вариантов CRISPR-нуклеазы BrCas12b (дикий тип и два мутанта), полученных с использованием упрощенной очистки, в типичном температурном диапазоне проведения LAMP – от 56°С до 72°С. Они показали, что применение одностадийной металл-хелатной хроматографии с исключением этапа энзиматического удаления N-концевых последовательностей, транслируемых вместе с целевым белком, позволяет получать рекомбинантные CRISPR-нуклеазы BrCas12b с достаточно высоким уровнем коллатеральной активности. Температурные зависимости коллатеральной активности различались у исследованных вариантов BrCas12b. Полученные результаты могут быть использованы при выборе термостабильных CRISPR-нуклеаз Cas12b для создания тест-систем на основе комбинирования LAMP и CRISPR/Cas-детекции.

##plugins.themes.bootstrap3.article.details##

Как цитировать
Курбатов L., Тимошенко O., Хмелева S., Птицын K., Супрун E., Радько S., & Лисица A. (2025). Температурная зависимость коллатеральной активности термостабильных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b, полученных одностадийной очисткой металл-хелатной хроматографией после гетерологической экспрессии. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 8(3), e00284. https://doi.org/10.18097/BMCRM00284
Выпуск
Том 8 № 3 (2025)
Раздел
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Библиографические ссылки

  1. van der Oost, J., Westra, E.R., Jackson, R.N., Wiedenheft, B. (2014) Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems. Nature Review Microbiology, 12(7), 479-492. DOI
  2. Kaminski, M.M., Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Zhang, F., Collins, J.J. (2021) CRISPR-based diagnostics. Nature Biomedical Engineering, 5(7), 643-656. DOI
  3. Fapohunda, F.O., Qiao, S., Pan, Y., Wang, H., Liu, Y., Chen, Q., Lu, P.(2022) CRISPR Cas system: A strategic approach in detection of nucleic acids. Microbiological Research, 259, 127000. DOI
  4. Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Lee, J.W., Essletzbichler, P., Dy, A.J., Joung, J., Verdine, V., Donghia, N., Daringer, N.M., Freije, C.A., Myhrvold, C., Bhattacharyya, R.P., Livny, J., Regev, A., Koonin, E.V., Hung, D.T., Sabeti, P.C.,Collins, J.J., Zhang, F. (2017) Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. DOI
  5. Chen, J.S., Ma, E., Harrington, L.B., Da Costa, M., Tian, X., Palefsky, J.M., Doudna, J.A. (2018) CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science, 360(6387), 436-439. DOI
  6. Piepenburg, O., Williams, C.H., Stemple, D.L., Armes, N.A. (2006) DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology, 4(7), e204. DOI
  7. Khmeleva, S. A., Ptitsyn, K. G., Kurbatov, L. K., Timoshenko, O. S.,Suprun, E. V., Radko, S. P., Lisitsa, A. V. (2024) Biosensing platforms forDNA diagnostics based on CRISPR/Cas nucleases: towards the detection of nucleic acids at the level of single molecules in non-laboratory settings. Biomeditsinskaya Khimiya, 70(5), 287-303. DOI
  8. Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanab,e K., Amino, N., Hase, T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12), e63. DOI
  9. Joung, J., Ladha, A., Saito, M., Kim, N.G., Woolley, A.E., Segel, M., Barretto, R.P.J., Ranu, A., Macrae, R.K., Faure, G., Ioannidi, E.I., Krajeski, R.N., Bruneau, R., Huang, M.W., Yu, X.G., Li, J.Z., Walker, B.D., Hung, D.T.,Greninger, A.L., Jerome, K.R., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Zhang, F.(2020) Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. The New England Journal of Medicine, 383(15), 1492-1494. DOI
  10. Teng, F., Cui, T., Feng, G., Guo, L., Xu, K., Gao, Q., Li, T., Li, J., Zhou,Q., Li, W. (2018) Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering. Cell Discovery, 27(4), 63. DOI
  11. Tian, Y., Liu, R.R., Xian, W.D., Xiong, M., Xiao, M., Li, W.J. (2020) A novel thermal Cas12b from a hot spring bacterium with high target mismatch tolerance and robust DNA cleavage efficiency. International Journal of Biological Macromolecules, 147, 376-384. DOI
  12. Nan, X., Hardinge, P., Hoehn, S., Dighe, S.N., Ukeri, J., Pease, D.F., Griffin, J., Warrington, J.I., Saud, Z., Hottinger, E., Webster, G., Jones, D., Kille, P., Weightman, A., Stanton, R., Castell, O.K., Murray, J.A.H., Jurkowski, T.P.(2023) VarLOCK: sequencing-independent, rapid detection of SARS-CoV-2 variants of concern for point-of-care testing, qPCR pipelines and national wastewater surveillance. Scientific Reports, 13(1), 20832. DOI
  13. Nguyen, L.T., Macaluso, N.C., Pizzano, B.L.M., Cash, M.N., Spacek, J., Karasek, J., Miller, M.R., Lednicky, J.A., Dinglasan, R.R., Salemi, M., Jain,P.K. (2022) A thermostable Cas12b from Brevibacillus leverages one-potdiscrimination of SARS-CoV-2 variants of concern. EBio Medicine, 77, 103926. DOI
  14. Nguyen, L.T., Rananaware, S.R., Yang, L.G., Macaluso, N.C., Ocana-Ortiz, J.E., Meister, K.S., Pizzano, B.L.M., Sandoval, L.S.W., Hautamaki, R.C., Fang,Z.R., Joseph, S.M., Shoemaker, G.M., Carman, D.R., Chang, L., Rakestraw,N.R., Zachary, J.F., Guerra, S., Perez, A., Jain, P.K. (2023) Engineering high lythermostable Cas12b via de novo structural analyses for one-pot detection of nucleic acids. Cell Reports Medicine, 4(5), 101037. DOI
  15. Kurbatov, L.K., Radko, S.P., Kravchenko, S.V., Kiseleva, O. I., Durmanov, N.D., Lisitsa, A. V. (2020) Single Stage Purification of CRISPR/Cas13a Nucleasevia Metal-Chelating Chromatography Following Heterologous Expression with the Preservation of Collateral Ribonuclease Activity. Applied Biochemistry andMicrobiology, 56(6), 671–677. DOI
  16. Kurbatov, L. K., Radko, S. P., Khmeleva, S. A., Ptitsyn, K. G., Timoshenko,O. S., Lisitsa, A. V. (2024) Application of DETECTR for Selective Detection of Bacterial Phytopathogen Dickeya solani Using Recombinant CRISPR-Nuclease Cas12a Obtained by Single-Stage Chromatographic Purification. Applied Biochemistry and Microbiology, 60(1), 17-25. DOI
  17. Habimana, J.D., Mukama, O., Chen, G., Chen, M., Amissah, O.B., Wang,L., Liu, Y., Sun, Y., Li, A.L., Deng, S., Huang, J., Yan, X.X., Rutaganda, T.,Mutangana, D., Wu, L.P., Huang, R., Li, Z. (2023) Harnessing enhanced CRISPR/Cas12a trans-cleavage activity with extended reporters and reductants for early diagnosis of Helicobacter pylori, the causative agent of peptic ulcersand stomach cancer. Biosensors and Bioelectronics, 222, 114939. DOI
  18. Ptitsyn, K. G, Khmeleva, S. A, Kurbatov, L. K, Timoshenko, O. S, Suprun, E. A, Radko, S. P, Lisitsa, A. V. (2024). Lamp Primer Designing Software: The Overview. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 7(4), e00226. DOI
  19. Kurbatov, L. K., Radko, S. P, Khmeleva, S. A., Timoshenko, O. S. Lisitsa,A. V. (2022) Standardization of Recombinant CRISPR/Cas13a-nuclease Preparations by Using RNase A of Known Activity. Biomedical Chemistry:Research and Methods, 5(4), e00177. DOI
  20. Hand, T.H., Das, A., Li, H. (2019). Directed evolution studies of athermophilic Type II-C Cas9. Methods in Enzymology, 616, 265–288. DOI
  21. Kumar, S., Tsai, C.J., Nussinov, R. (2000) Factors enhancing protein thermostability. Protein Engineering, 13(3), 179–191. DOI