Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека
##plugins.themes.bootstrap3.article.main##
Аннотация
Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия.
##plugins.themes.bootstrap3.article.details##
Библиографические ссылки
- Ershov, P., Mezentsev, Y., Gnedenko, O., Mukha, D., Yantsevich, A., Britikov, V., Kaluzhskiy, L., Yablokov, E., Molnar, A., Ivanov, A., Lisitsa, A., Gilep, A., Usanov, S., Archakov, A. (2012) Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: experimental simulation and SPR validation. Proteomics, 12(22), 3295-3298. DOI
- Ivanov, A.S., Medvedev, A., Ershov, P., Molnar, A., Mezentsev, Y., Yablokov, E., Kaluzhsky, L., Gnedenko, O., Buneeva, O., Haidukevich, I., Sergeev, G., Lushchyk, A., Yantsevich, A., Medvedeva, M., Kozin, S., Popov, I., Novikova, S., Zgoda, V., Gilep, A., Usanov, S., Lisitsa, A., Archakov, A. (2014) Protein interactomics based on direct molecular fishing on paramagnetic particles: Practical realization and further SPR validation. Proteomics, 14(20), 2261-2274. DOI
- Ivanov, A.S., Ershov, P.V., Molnar, A.A., Mezentsev, Yu.V., Kaluzhskiy, L.A., Yablokov, E.O., Florinskaya, A.V., Gnedenko, O.V., Medvedev, A.E., Kozin, S.A., Mitkevich, V.A., Makarov, A.A., Gilep, A.A., Luschik, A.Ya., Gaidukevich, I.V., Usanov S.A. (2016) Direct molecular fishing in molecular partners investigation in protein–protein and protein–peptide interactions. RJBC, 42(1), 14-21. DOI
- Svirid, A.V., Ershov, P.V., Yablokov, E.O., Kaluzhskiy, L.A., Mezentsev, Y.V., Florinskaya, A.V., Sushko, T.A., Strushkevich, N.V., Gilep, A.A., Usanov, S.A., Medvedev, A.E., Ivanov, A.S. (2017) Direct molecular fishing of new protein partners for human thromboxane synthase. Acta Naturae. 9(4), 92-100.
- Florinskaya, A., Ershov, P., Mezentsev, Y., Kaluzhskiy, L., Yablokov, E., Medvedev, A., Ivanov, A. (2018) SPR Biosensors in Direct Molecular Fishing: Implications for Protein Interactomics. Sensors (Basel), 18(5), 1616. DOI
- Gilep, A.A., Guryev. O.L., Usanov, S.A., Estabrook, R.W. (2001) Apo-cytochrome b5 as an indicator of changes in heme accessability: preliminary studies with cytochrome P450 3A4. J. Inorg. Biochem., 87(4), 237-244. DOI
- Usanov, S.A., Graham, S.E., Lepesheva, G.I., Azeva, T.N., Strushkevich, N.V., Gilep, A.A., Estabrook, R.W., Peterson, J.A. (2002) Probing the interaction of bovine cytochrome P450scc (CYP11A1) with adrenodoxin: evaluating site-directed mutations by molecular modeling. Biochemistry, 41(26), 8310–8320. DOI
- Sergeev, G.V., Gilep, A.A. & Usanov S.A. (2014) The role of cytochrome b5 structural domains in interaction with cytochromes P450. Biochemistry (Moscow), 79(5), 406-416. DOI
- Naryzhny, S.N., Maynskova, M.A., Zgoda, V.G., Ronzhina, N.L., Kleyst, O.A., Vakhrushev, I.V., Archakov, A.I. (2016) Virtual-Experimental 2DE Approach in Chromosome-Centric Human Proteome Project. J. Proteome Res., 15(2), 525–530. DOI
- Mezentsev, Yu.V., Molnar, A.A., Gnedenko, O.V., Krasotkina, Yu.V., Sokolov, N.N., Ivanov, A.S. (2006) Oligomerization of L-asparaginase from Erwinia carotovora. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B, 1(1), 58-67. DOI
- Mezentsev, Yu.V., Molnar, A.A., Sokolov, N.N., Lisitsina, V.B., Shatskaya, M.A., Ivanov, A.S., Archakov, A.I. (2011) Specificity of Molecular Recognition in Oligomerization of Bacterial L-Asparaginases. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B, 5(2), 124-134. DOI
- Ershov, P.V., Gnedenko, O.V., Mol'nar, A.A., Lisitsa, A.V., Ivanov, A.S., Archakov, A.I. (2009) Biosensor analysis of interaction of potential dimerization inhibitors with HIV-1 protease. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B, 3(3), 272-288. DOI
- Ershov, P., Mezentsev, Y., Gilep, A., Usanov, S., Buneeva, O., Medvedev, A., Ivanov, A. (2017) Isatin-induced increase in the affinity of human ferrochelatase and adrenodoxin reductase interaction. Protein Sci., 26(12), 2458-2462. DOI
- Fleischmann, G., Fisette, O., Thomas, C., Wieneke, R., Tumulka, F., Schneeweiss, C., Springer, S., Schäfer, L.V., Tampé, R. (2015) Mechanistic Basis for Epitope Proofreading in the Peptide-Loading Complex. J. Immunol., 195(9), 4503-4513. DOI