|
ТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КОЛЛАТЕРАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ CRISPR-НУКЛЕАЗ Cas12b, ПОЛУЧЕННЫХ ОДНОСТАДИЙНОЙ ОЧИСТКОЙ МЕТАЛЛ-ХЕЛАТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ ПОСЛЕ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ 1Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119435, Москва, Погодинская ул., 10; *e-mail: kurbatovl@mail.ru Ключевые слова: рекомбинантная CRISPR-нуклеаза Cas12b; одностадийная очистка; коллатеральная нуклеазная активность; температурная зависимость DOI: 10.18097/BMCRM00284 ВВЕДЕНИЕ Стремительное развитие методов молекулярной диагностики патогенных микроорганизмов и вирусов на основе комбинирования методов амплификации нуклеиновых кислот и селективной CRISPR/Cas-детекции специфических ампликонов (CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats; Cas, CRISPR associated protein, [1]) сформировало запрос на поиск новых и модификацию известных CRISPR-нуклеаз, используемых в таких системах [2, 3]. Наибольшее развитие получили две технологии детекции, известные как SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter un-LOCKing) на основе активности CRISPR-нуклеазы Cas13а [4] и DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) с использованием CRISPR-нуклеазы Cas12a [5]. В обоих случаях на первом этапе проводится амплификация нуклеиновых кислот (в случае РНК – с использованием этапа обратной транскрипции) с помощью изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации, протекающей при постоянной температуре 37°С-42°С [6]. Это обстоятельство позволяет не только совместить в одной пробирке реакции амлификации и CRISPR-детекции [7], но и осуществлять диагностику во «внелабораторном» формате (англ. point-of-care testing или, в более широком контексте, point-of-need testing) [2, 3]. Однако до настоящего времени наиболее широко распространённым методом амплификации нуклеиновых кислот остаётся петлевая изотермическая амплификация (loop-mediated isothermal amplification, LAMP), разработанная в 2000 году Notomi и соавт. [8]. К преимуществам данного метода можно отнести большую доступность реагентов для проведения реакции, использование в процессе только одного фермента – Bst-полимеразы – и совместимость стандартных буферов для проведения LAMP с анализом ампликонов CRISPR-нуклеазами [9]. Однако LAMP наиболее часто проводится в диапазоне температур от 60°С до 65°С, и оптимальная температура амплификации определяется последовательностями используемых праймеров [7]. Таким образом, сопряжение LAMP с CRISPR-детекцией ампликонов возможно либо за счет разделения анализа на два независимых этапа, либо за счет использования термостабильных CRISPR-нуклеаз, сохраняющих активность при высоких температурах, что позволяет выполнять анализ в одной тест-пробирке (англ. one-pot assay). Разделение анализа на два этапа нежелательно, поскольку сопряжено с открытием тест-пробирок с продуктами LAMP, что может привести к аэрозольному загрязнению места проведения анализа ампликонами и ложноположительным результатам. Наибольшее применение в практике создания тест-систем на основе сопряжения LAMP с CRISPR-детекцией ампликонов в формате «one-pot assay» нашли термостабильные CRISPR-нуклеазы AapCas12b, полученная из термоацидофильной бактерии Alicyclobacillus acidiphilus [10], и BrCas12b, полученная из бактерий штамма SYP-B805 рода Brevibacillus, обнаруженного в горячих источниках [11]. Обе CRISPR-нуклеазы в виде рекомбинантных белков успешно использованы в создании тест-систем для обнаружения генов SARS-CoV-2 [12, 13], однако при температурах выше 60°С коллатеральная активность AapCas12b критически снижалась, в то время как для нуклеазы BrCas12b она сохранялась до порога 63°С [13]. Для повышения термостабильности рекомбинатной CRISPR-нуклеазы BrCas12b, Nguyen и соавт. [14] с помощью направленного мутагенеза получили ряд мутантов, из которых варианты BrCas12b-FNLDTA и BrCas12b-RFND показали наибольшую эффективность в формате совмещения LAMP и CRISPR-детекции в одной тест-пробирке, сохраняя достаточный уровень коллатеральной активности до температуры 67°С. Для получения рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b в вышеприведенных работах использовали стандартный подход с индукцией экспрессии при пониженных температурах (18°С) и последующей очисткой с помощью металл-хелатной хроматографии [11-14]. Целевой белок получали в виде единой полипептидной цепи, содержащей дополнительную N-концевую последовательность (N-таг) для хроматографической очистки, отделённую от последовательности CRISPR-нуклеаз Cas12b сайтом (сайтами) расщепления протеаз. При этом обязательным этапом очистки было энзиматическое удаление N-тага в целевом белке путем его обработки специфическими протеазами [11-14], что удлиняло и усложняло процедуру очистки. В то же время ранее нами была показана возможность получения функционально активных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas13а [15] и Cas12a [16] без этапа удаления N-тагов. Использование одностадийной очистки позволяет не только снизить общие затраты времени и ресурсов, но и существенно увеличить выход нуклеаз, предотвращая возможный протеолиз целевого продукта. Применение такого же подхода к очистке CRISPR-нуклеазы Cas12b, при условии сохранения функциональной активности, может существенно упростить её получение для использования в тест-системах на основе технологии LAMP/Cas12b в формате «one-pot assay». Цель данной работы заключалась в сравнительной оценке коллатеральной активности термостабильных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз AapCas12b и BrCas12b («дикий тип» и два мутантных варианта BrCas12b-RFND и BrCas12b-FNLDTA), полученных с использованием одностадийной очистки. Активность оценивали в широком температурном диапазоне, совместимом с проведением LAMP. Полученные температурные зависимости позволят обосновать рациональный выбор определённого варианта CRISPR-нуклеазы Cas12b для сопряжения с оптимальной температурой проведения LAMP для использования в тест-системах на основе технологии LAMP/Cas12b. МЕТОДИКА Реагенты В работе использовали ДНК-олигонуклеотиды, синтезированные и очищенные методом ВЭЖХ компаниями «Люмипроб» (Россия) и «Евроген» (Россия). Все реактивы, использованные для приготовления буферных растворов, были приобретены в компании «Merck» (США) и соответствовали степени чистоты «ХЧ» или «ОСЧ». Реактивы без указания источника получения, использованные для гетерологической экспрессии и очистки рекомбинантных белков, были получены из компании «Диа-М» (Россия). Растворы готовили с использованием деионизованной воды качества Milli-Q (18 МΩ·см). Гетерологическая экспрессия и одностадийная очистка рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b Для экспрессии рекомбинантных Cas12b-нуклеаз использовали плазмидные векторы 6xHis-MBP-BrCas12b-RFND, 6xHis-MBP-BrCas12b-FNLDTA, 6xHis-MBP-BrCas12b и pAG001 His6-TwinStrep-SUMO-AapCas12b, предоставленные компанией «HonorGene» (Китай). Все плазмиды были трансформированы в штамм Rosetta™ 2(DE3)pLysS Singles™ Competent Cells («Merck», Германия). Для получения рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b трансформированные клетки культивировали, как описано ранее [16], со следующими модификациями. При достижении оптической плотности D600 = 0.6-0.8 при культивировании в среде Terrific Broth, колбы с культурой инкубировали на льду в течение 30 мин, после чего добавляли индуктор экспрессии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 50 мкМ. Экспрессию целевого белка проводили в течение 16-18 ч при 18°С. Клетки осаждали центрифугированием (4000 g, 15 мин, 4°С), промывали фосфатно-солевым буфером и замораживали при –80°С. Клеточные осадки использовали для получения целевого белка. Очистку целевого белка осуществляли на колонках Protino Ni-TED 1000 («Macherey-Nagel», Германия) в соответствии с протоколом производителя. Замороженные клеточные осадки ресуспендировали либо в буфере LEW (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 1 мМ PMSF, 1 мг/мл лизоцима, pH 8.0) из набора к колонкам Protino Ni-TED 1000 в соотношении 1 г осадка на 2 мл буфера, либо в одном из буферных растворов, использованных в [12] и [14] для получения рекомбинантных CRISPR-нуклеаз AapCas12b и BrCas12b (соответственно 20 мМ Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 1 мМ DTT, 10% глицерола, 1 мМ PMSF, pH 7.5 или 0.5 M NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 0.5 мМ TCEP, 0.25 мг/мл лизоцима, 10 мг/мл дезоксирибонуклеазы I, 1 мМ PMSF, pH 7.5). После инкубации на льду в течение 30 мин, клетки разрушали механическим способом с помощью френч-пресса FA-078AE («Thermo Electron Corporation», США). Поскольку полученный лизат имел повышенную вязкость из-за присутствия ДНК, проводили его дополнительную обработку на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopuls HD2070 («Bandelin», Германия) во льду. Лизат осветляли центрифугированием 40 мин при 20000 g и 4°С и наносили на колонку Ni-TED. Промывку и элюцию связавшегося материала производили по ранее описанной методике [16], используя буферные растворы LEW и LEW с добавлением 250 мМ имидазола соответственно. Альтернативно, связавшийся материал промывали и элюировали буферными растворами, содержащими 0.5 M NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 20 мМ имидазол, 0.5 мМ TCEP, pH 7.5 и 0.5 M NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 300 мМ имидазол, 0.5 мМ TCEP, pH 7.5 соответственно, как описано в [14] для BrCas12b. При очистке CRISPR-нуклеазы AapCas12b колонку промывали сначала буфером, содержащим 20 мМ Tris-HCl, 0.5 M NaCl и 10 мМ имидазол (pH 7.5), после чего связавшийся белок элюировали этим же буфером с добавлением 250 мМ имидазола. Собранные фракции анализировали методом электрофореза по Лэммли в 9% полиакриламидном геле (ПААГ) с окраской красителем Кумасси G-250 («Bio-Rad», США), как описано ранее [15]. Количество целевого белка определяли методом денситометрии ПААГ, используя для построения калибровочной прямой образцы бычьего сывороточного альбумина (БСА) известной концентрации, как в работе [16]. Содержащие целевой белок фракции объединяли и переводили в буфер для хранения (буфер С: 20 мМ HEPES, 500 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 5% глицерин, pH 7.5) с помощью центрифужных концентраторов Vivaspin 2 («Sartoruis Stedim», Германия). Дополнительно, в качестве буферов для хранения целевого белка использовали буферы А и В, соответственно содержащие 10 мМ Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 мМ DTT, 50% глицерин, pH 7.5 [12] и 150 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, 0.5 мМ TCEP, pH 7.0 [14]. Для перевода в буфер А для хранения использовался двухступенчатый диализ через мембрану SnakeSkin Dialysis Tubing 7000 MWCO («Thermo Fisher Scientific», США), как описано в [12]. Синтез направляющей РНК и получение ДНК-мишени Синтетическую ДНК-мишень SARS-T получали, смешивая эквимолярные количества олигонуклеотидов SARS-T-F и SARS-T-R (таблица 1). Смесь инкубировали 5 мин при 96°С с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Для синтеза направляющей РНК (нРНК) готовили ДНК-матрицу, содержащую на 3′-конце участок, комплементарный последовательности промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 (табл. 1). ДНК-матрицу готовили лигированием ДНК-олигонуклеотидов длиной 40-50 нуклеотидов (нт), химически фосфорилированных на 5′-конце, с перекрывающимися комплементарными участками длиной 20-30 нт. Смесь ДНК-олигонуклеотидов в буфере для лигирования (T4 DNA Ligase Reaction Buffer, «New England Biolabs», США) инкубировали 5 мин при 96°С и медленно охлаждали до комнатной температуры. После добавления Т4-лигазы («New England Biolabs») до конечной концентрации 120 Ед/мкл, смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Полученные фрагменты ДНК амплифицировали методом ПЦР, используя режим амплификации 5 мин при 95°С, затем 30 циклов по 15 сек при 95°С, 58°С и 72°С, за которыми следовала элонгация – 2 мин при 72°С. ПЦР проводили с праймерами 5′-CAGCGCTTCAGCGTTCTTC-3′ и 5′-TAATACGACTCACTATAGGGGA-3′, используя ПЦР-набор «HS Taq ДНК-полимераза» («Евроген», Россия). Ампликоны очищали с использованием набора «Cleanup Standard» («Евроген») в соответствии с протоколом производителя. Соответствие последовательности полученных ампликонов ожидаемой последовательности ДНК-матрицы для синтеза нРНК (gRNA DNA template, табл. 1) контролировали секвенированием. Секвенирование выполнялось компанией «Евроген». РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Использование упрощенной одностадийной очистки целевого белка методом металл-хелатной хроматографии позволяет сократить затраты времени и ресурсов на получение функционально активных рекомбинантных CRISPR/Cas-нуклеаз. Такой подход был нами ранее успешно реализован при получении рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12a и Cas13a с сохранением их коллатеральной активности [15, 16]. В обоих случаях очищенный целевой белок фактически представлял белок слияния (fusion protein). В случае Cas12a-нуклеазы, белок слияния имел N-концевой мотив, состоящий из 6 остатков гистидина, за которым следовали последовательность мальтозо-связывающего белка (молекулярная масса около 42 кДа), последовательность сайта узнавания для TEV-протеазы из 7 аминокислотных остатков (а.о.) и последовательность самой нуклеазы (около 150 кДа). В случае Cas13a-нуклеазы белок слияния также включал N-концевой мотив из 6 остатков гистидина и заканчивался последовательностью нуклеазы (молекулярный размер – около 144 кДа), но между ними располагались аминокислотные последовательности стрептавидинового тага (Twin-Strep-tag, молекулярная масса «вставки» около 3 кДа) и сайта узнавания SUMO-протеазы (размер «вставки» около 11 кДа). В данной работе рекомбинантная нуклеаза AapCas12b была получена как белок слияния, аналогичный ранее полученному для Cas13a-нуклеазы [15], а нуклеазы BrCas12b, BrCas12b-FNLDTA и BrCas12b-RFND – как белки слияния, аналогичные белку слияния для Cas12a-нуклеазы [16]. Для удобства дальнейшего изложения, рекомбинантные CRISPR/Cas-нуклеазы, получаемые в виде белка слияния (fusion protein), будут обозначаться как «fp-название нуклеазы». Для сравнительной оценки коллатеральной нуклеазной активности рекомбинантных белков fp-AapCas12b, fp-BrCas12b, fp-BrCas12b-FNLDTA и fp-BrCas12b-RFND был проведен экспериментальный анализ скорости расщепления молекулярного репортёра, FAM-TTATT-BHQ1, в одинаковых условиях при трёх температурах – 56°С, 64°С и 72°С. Выбор температур был обусловлен тем, что температура 64°С находится в диапазоне, наиболее часто используемом для проведения LAMP (60°С–65°С), а температуры 56°С и 72°С близки к нижнему и верхнему пределам температур, совместимых с LAMP [18]. Следует отметить, что амплификация при 72°С требует использования определённой полимеразы, а именно Bst 3.0 («New England Biolabs»). В качестве мишени служил химически синтезированный участок гена N, кодирующего белок нуклеокапсида вируса SARS-CoV-2, ранее использованный как мишень для комплексов нРНК с нуклеазой BrCas12b и её мутантными вариантами в работе [14], а композиция буферного раствора для выполнения кинетического анализа была совместима с проведением реакции LAMP. На рисунке 1 представлены репрезентативные кинетические кривые расщепления репортёров. Как можно видеть, все четыре рекомбинантные нуклеазы, полученные в виде белков слияния и имеющие в своем составе последовательности N-тагов, не утратили способность проявлять коллатеральную активностью в температурном диапазоне 56°С–72°С. При этом коллатеральная активность fp-AapCas12b была значительно ниже активности, наблюдаемой для белков слияния, полученных для трех вариантов нуклеазы BrCas12b.
В целом полученный результат согласуется с данными работы [14], где было продемонстрировано многократное превышение уровня коллатеральной активности у мутантов BrCas12b по сравнению с AapCas12b в температурном диапазоне проведения LAMP. Однако в нашем случае не было выявлено резкого падения коллатеральной активности с ростом температуры выше 60°С, наблюдаемого в работе [13]. Следует отметить, что в работах [11-14] для получения рекомбинантных нуклеаз AapCas12b и BrCas12b (а также её мутантных вариантов) при лизисе клеток использовали буферные растворы разной композиции, в то время как в нашем случае разрушение клеток проходило в одинаковом буферном растворе (композиции буферных растворов приведены в разделе «Методика»). Однако использование таких же буферных растворов для лизиса клеток, как в работах [11-14], при получении рекомбинантных нуклеаз по упрощенной методике с одностадийной хроматографической очисткой не привело к сколь-либо существенному изменению кинетики расщепления репортёров по сравнению с представленной на рисунке 1 (данные не показаны). Следует отметить, что в этом случае получаемые белковые продукты переводились для хранения в буферные растворы А и В (раздел «Методика») соответственно [11-14]. Таким образом, различия в температурной зависимости коллатеральной активности между AapCas12b [13] и fp-AapCas12b скорее всего связаны с влиянием N-тагов. Кроме того, рекомбинантный белок fp-BrCas12b, который включает аминокислотную последовательность нуклеазы BrCas12b «дикого типа», практически не уступал по уровню коллатеральной активности белкам fp-BrCas12b-FNLDTA и fp-BrCas12b-RFND, содержащим последовательность мутантов BrCas12b, при температурах 56°С и 64°С, но заметно превосходил их при температуре 72°С (рис. 1). Такое поведение существенно отличалось от поведения рекомбинантных нуклеаз BrCas12b, BrCas12b-RFND и BrCas12b-FNLDTA, наблюдаемого в работе [14], где мутанты значительно превосходили «дикий тип» по уровню коллатеральной активности при повышении температуры. Для более детального изучения температурной зависимости коллатеральной активности рекомбинантных Cas12b-нуклеаз, получаемых в виде белков слияния, было проведено тестирование с меньшим температурным инкрементом, а именно с шагом в два градуса, в том же температурном диапазоне 56°С–72°С. Поскольку уровень коллатеральной активности у fp-AapCas12b был существенно ниже, чем у fp-BrCas12b, fp-BrCas12b-FNLDTA и fp-BrCas12b-RFND при всех трех ранее тестированных температурах (рис. 1), данный рекомбинантный белок был исключен нами из дальнейшего анализа. На рисунке 2 результаты проведенного анализа представлены как гистограммы, показывающие средние значения начальной скорости V0 расщепления репортёров активированными fp-BrCas12b, fp-BrCas12b-FNLDTA и fp-BrCas12b-RFND при тестированных температурах реакции. Начальную скорость V0 рассчитывали, как описано в статье [19]. Она представляет собой тангенс угла наклона начального прямолинейного участка кинетических зависимостей (зависимостей флуоресценции от времени, аналогичным представленным на рисунке 1). Как можно видеть из рисунка 2, рекомбинантные белки fp-BrCas12b, fp-BrCas12b-FNLDTA и fp-BrCas12b-RFND различаются между собой как по температурному профилю уровня коллатеральной активности, так и по его абсолютному значению. Так, для fp-BrCas12b-FNLDTA оптимальными были значения температуры в диапазоне от 60°С до 64°С, а максимальная величина начальной скорости составила всего 800 у.е./мин (рис. 2А). При этом активность нуклеазы плавно снижалась с повышением и понижением температуры от уровня оптимальных температур. В случае с fp-BrCas12b-RFND максимальные показатели V0 достигались в диапазоне от 58°С до 64°С и составляли 1300-1400 у.е./мин (рисунок 2B), при этом при всех температурах средние значения V0 были выше, чем для fp-BrCas12b-FNLDTA. Наиболее интересным было поведение рекомбинантного белка fp-BrCas12b, содержащего последовательность нуклеазы «дикого типа». Он показал более высокие уровни коллатеральной активности, чем fp-BrCas12b- FNLDTA и fp-BrCas12b-RFND, во всем температурном диапазоне, при этом значения V0 уменьшались не более чем в два раза при повышении температуры реакции от 58°С-62°С до 68°С -72°С (рисунок 2C). Это контрастирует с поведением рекомбинантной CRISPR-нуклеазы BrCas12b, которая практически полностью теряла способность к неспецифическому расщеплению молекул-репортеров в присутствии ДНК-мишени при температуре 68°С и выше [14]. Однако следует отметить, что при температуре 70°С наблюдалась высокая вариабельность значений V0 для fp-BrCas12b, причины которой остались неясны. Тем не менее, такая высокая вариабельность при данной температуре может негативно сказываться при использовании рекомбинантного белка fp-BrCas12b в тестах, требующих проведения LAMP при повышенной температуре.
Ещё одной методической особенностью нашего протокола является отличие буферных растворов для промывки и элюции целевого белка, связавшегося на сорбенте Ni-TED, от использованных в работе [14] для получения рекомбинантной нуклеазы BrCas12b и её мутантных вариантов. Однако использование таких же буферных растворов, как в работе [14] (раздел «Методика»), не привело в нашем случае к улучшению функциональных характеристик fp-BrCas12b, fp-BrCas12b-RFND и fp-BrCas12b-FNLDTA (рис. 3). В то время как температурные профили коллатеральной активности практически не изменились, значения V0 были во всех случаях заметно ниже – от 30% до 60% (рис. 2, 3). Следует отметить, что мы использовали для промывки и элюции буферные растворы, состав которых оптимизирован производителем колонок Protino Ni-TED 1000 для проведения данных процедур. Возможно, использование оптимизированных для данных колонок буферных растворов позволяет увеличить долю функционально активного целевого белка в элюате. При этом стоит отметить, что для любых из использованных буферных растворов степень очистки, контролируемая с помощью ПААГ, была практически одинаковой. Известно, что термостабильность ферментов, включая CRISPR/Cas-нуклеазы, определяется особенностями формирования их вторичной и третичной структуры [20, 21]. В настоящее время нам сложно представить механистическое объяснение того, как наличие дополнительных доменов в белке слияния, содержащем домены CRISPR-нуклеазы, может влиять на термостабильность последних. Тем не менее, наличие дополнительных доменов не только не привело к утере способности BrCas12b-нуклеазы как части белка слияния проявлять коллатеральную нуклеазную активность, но даже улучшило её термостабильность по сравнению со специально отобранными термостабильными мутантными вариантами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Термостабильные рекомбинантные CRISPR-нуклеазы Cas12b могут быть получены с использованием упрощенной одностадийной процедуры очистки на основе метода металл-хелатной хроматографии в виде белков слияния. Несмотря на наличие аминокислотных последовательностей N-тагов, такие белки слияния сохраняют способность доменов Cas12b-нуклеаз к формированию комплексов с нРНК, активации и проявлению коллатеральной нуклеазной активности в отношении однонитевой ДНК в температурном диапазоне 56°С–72°С. Это делает их пригодными для сопряжения с LAMP и использования в тест-системах, нацеленных на проведение ДНК-диагностики во внелабораторном формате. Среди тестированных Cas12b-нуклеаз, BrCas12b в виде белка слияния показала наибольшую коллатеральную активность во всем исследованном температурном диапазоне (56°С–72°С), однако характеризовалась нестабильностью в уровне активности при температуре 70°С. Белок слияния, содержащий мутантный вариант нуклеазы, BrCas12bRFND, имеет выраженный температурный оптимум в интервале от 58°С до 64°С и характеризуется высоким значением и стабильностью уровня коллатеральной активности. СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ Данная работа не связана с исследованиями, в которых в качестве объекта выступают люди или животные. ФИНАНСИРОВАНИЕ Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021 - 2030 годы) (No 122030100170-5) КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ЛИТЕРАТУРА
|
